功能化生物墨水传递生物分子用于治疗颅面疾病 (DART-CRAFT)

为了开发可塑的生物合成胶原蛋白聚合物基质，将对商业明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）基水凝胶进行生化修饰，以微调其假塑性和屈服应力，并进行功能化以实现药物输送以改善生物特性。 GelMA 将富含以下化学成分： 粘合剂分子（例如 藻酸盐基或离子释放无机化合物），如果需要，可增加颅面重建中使用的可植入材料的粘附力，硫醇基非裂解型光引发剂（例如光引发剂） eosinY 与三乙醇胺和乙烯基己内酰胺结合）可实现可见光激活交联并最大限度地减少紫外线的安全问题。 光交联将通过便携式可见光设备（420-480 nm）实现，以诱导生物墨水的胶凝。 将根据标准化程序分析不同 GelMA 化合物的物理特性（形态、粘弹性、刚度、抗外加应力）。 GelMA 的粘合性能将通过干燥条件下的搭接剪切强度测试来测量。 一旦鉴定出具有最高生物学特性的 GelMA 化合物，将赋予其功能化聚乳酸乙醇酸 (PLGA) 纳米颗粒 (NP)。

为此，将合成生物相容性 PLGA-聚乙二醇 (PEG) 纳米粒子，并用双砜进行功能化，以结合表面上的靶向部分。 合成涉及PLGA活化、PLGA-PEG缀合、双砜活化和PLGA-PEG-双砜缀合。 PLGA/PEG 比例将根据疏水性/亲水性有效负载进行调整。 双砜用于选择性、高效地对蛋白质的二硫键进行聚乙二醇化，或根据标准化方法结合组氨酸标签的蛋白质/肽，以实现特定的细胞靶向或抗菌剂。 高效液相色谱（HPLC）将用于验证生物合成反应。 动态光散射 (DLS)、纳米颗粒跟踪分析 (NTA) 和扫描电子显微镜 (SEM) 将定义最终构建体的形态和超微结构特性。 表面等离子共振将验证目标识别。 然后，按照标准化生产流程，通过挤出3D打印实现GelMA-NP混合复合材料的组装。 水凝胶和 NP 悬浮液将在压力和温度控制下通过单独的喷嘴以 100-1000 nm 特征尺寸的 2D 和 3D 图案进行分配。 将使用标量 NP 浓度，然后进行评估。

将通过将负载有荧光化合物的 GelMA-NP 与仿生细胞生长培养基一起浸没，并在时间过程实验中定量上清液中释放的 NP，来研究 GelMA 中的 NP 完整性和释放动态。 NP 定量将使用紫外-可见光谱、荧光光谱或粒子计数（例如 NTA 系统）进行。 将通过透射电子显微镜 (TEM) 和 DLS 研究纳米粒子的完整性。

一旦对 GelMA-NP 进行生化表征，它们将用于传递通过蛋白质组学数据鉴定的生物活性化合物，如下所述。

为了在体外颅面疾病模型中验证开发的生物墨水，将选择接受颅面手术的颅面畸形患者并参加该研究。 具体来说，将招募患有颅缝早闭和其他先天缺陷、创伤或脑肿瘤而接受颅骨手术的儿科患者。 接受颅面手术的成年患者也将被选择并入组颅面创伤和肿瘤。 为此，在获得签署的知情同意书（如果是儿童，则由父母签署）后，将获得来自儿童和成人患者的颅骨组织标本，作为开颅手术或颅顶重建期间的手术废物。 对于每位患者，废组织将被随机分成三等份。 其中，将在细胞生长培养基中收集 1 等分试样，用于将骨组织样本接种到培养板中以分离间充质基质细胞 (MSC)。 此后，MSC 将扩展到第 3 代培养物，并在生物样本库基础设施中收集，并附带相关的匿名临床数据和优化的跟踪系统，用于后续分析，如下所示。 基于 GelMA 的生物墨水 NP 释放和生物相容性将使用 MSC 进行分析，通过功能测定来：评估粘着斑动力学并通过免疫荧光测定研究细胞对凝胶化生物墨水的粘附。 将使用活细胞成像系统（Incucyte 活细胞分析系统）在时间过程实验中测量细胞行为和活力。

此外，2 等分的患者骨组织标本将在液氮中速冻（将其浸入含有蛋白酶抑制剂的冷冻保护介质中后）。 将使用内部标准化方案从这些样品中分离蛋白质和代谢物。 然后使用过滤辅助样品制备 (FASP) 消化方案对提取的样品进行消化。 然后，将通过液相色谱串联质谱法 (LC-MS/MS) 分析样品。 代谢物也将通过 LC-MS/MS 进行评估，并通过 HPLC 进行分离。 然后，获得的蛋白质和代谢物结果将通过集成途径分析（使用 IPA）进行分析，以实现每位患者的多组学分析，从而确定药物设计中可利用的可成药靶点。 计算药物设计工具，包括分子对接和虚拟筛选，将用于从药物/化学数据库中识别出能够与综合组学概况数据集中选定的靶标相互作用的先导化合物。 将通过分子动力学 (MD) 模拟来研究靶标-配体复合物的动态行为、稳定性和结合相互作用，以分析结合基序和热点。 基于医学博士的关于分子相互作用的见解将指导新型化合物的设计和优化。 这将涉及将结构修饰与基于配体的方法相结合，并进行虚拟筛选以增强结合亲和力、选择性和药物相似性。 通过这些计算机研究鉴定出的生物分子将被商业购买并封装在 PLGA NP 中。 在这方面，纳米沉淀和单乳液将用于疏水性有效负载，而双乳液溶剂蒸发技术（w1/o/w2）将用于亲水性有效负载。 之后，递送选定化合物的 PLGA 将复合到水凝胶 (GelMA) 基质中。 传递生物分子的生物墨水化合物的功能营养和促再生特性将在 MSC 中进行评估，以测试成骨特性 - 通过 ALP 活性测定、体外矿化染色和标记基因表达分析。 此外，人脐静脉内皮细胞（商业系列）将用 GelMA-NPs-药物复合物处理，通过对体外形成的毛细血管样结构进行计数和大小评估（管形成测定）来评估血管生成特性。

此外，还将从常规临床检查中收集一小部分外周静脉血（儿童患者2-3毫升，成人患者最多7毫升）。 使用Ficoll密度梯度离心技术从全血样本中分离PBMC。 然后通过CD14抗体缀合的磁珠分离单核细胞/巨噬细胞，并与因子（即， M-CSF、RANKL）形成成熟的破骨细胞。 这些将用于评估 GelMA-NP 化合物的生物可吸收性。 简而言之，破骨细胞将被接种在 GelMA-NP 纳米图案表面上，并通过免疫荧光分析评估典型破骨细胞特异性标记物的表达。 SEM 和免疫荧光测定将用于对破骨细胞-生物墨水界面进行超结构可视化，并区分二维和三维吸收。

来自患者的 MSC/骨祖细胞和破骨细胞也将用于获得 2D 和 3D 体外培养物，以模拟骨-植入物边界处存在的生物微环境，以验证所开发的生物墨水复合物。 根据每次测试的目的，生物墨水组件将与细胞一起进行生物打印（即通过独立喷嘴输送的细胞）以形成充满细胞的模型，或者打印在细胞培养容器的生长表面上并在细胞接种前胶凝。 将如上所述评估 NP 从 GelMA 的释放动力学、细胞活力和增殖、血管生成和骨再生作用。

为了测试其抗菌效果，将卸载的 GelMA 和 GelMA-NP 都打印到培养皿上并使其凝固。 此后，它将与机会性细菌菌株（大肠杆菌）一起孵育。 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形链球菌、粪肠球菌和铜绿假单胞菌）在适当的培养液中过夜。 将比较评估细菌粘附和计数，测试剂量和时间相关的效果。 SEM 成像也将支持 GelMA-NP 优于 GelMA 的抗菌活性。