Bioink fonctionnalisé fournissant des biomolécules pour le traitement des maladies craniofaciales (DART-CRAFT)

Pour développer une matrice polymère biosynthétique moulable à base de collagène, des hydrogels commerciaux à base de gélatine-méthacrylamide (GelMA) seront modifiés biochimiquement pour affiner leur pseudo-plasticité et leur limite d'élasticité, et fonctionnalisés pour mettre en œuvre l'administration de médicaments pour des propriétés biologiques améliorées. Le GelMA sera enrichi chimiquement avec : des molécules adhésives (par ex. à base d'alginate ou de composés inorganiques libérant des ions), si nécessaire, pour augmenter l'adhésion aux matériaux implantables utilisés dans la reconstruction cranio-faciale, des photoinitiateurs de type non clivés à base de thiol (par ex. l'éosineY combinée à la triéthanolamine et au vinyl caprolactame) pour permettre une réticulation activée par la lumière visible et minimiser les problèmes de sécurité liés à la lumière UV. La photo-réticulation sera réalisée grâce à un appareil portable à lumière visible (420-480 nm) pour induire la gélification du bioink. Les propriétés physiques (morphologie, propriétés viscoélastiques, rigidité, résistance à une contrainte appliquée) des différents composés GelMA seront analysées selon des procédures standardisées. Les propriétés adhésives du GelMA seront mesurées par des tests de résistance au cisaillement en conditions sèches. Une fois identifiés les composés GelMA présentant les caractéristiques biologiques les plus élevées, ils seront dotés de nanoparticules (NP) fonctionnalisées à base de poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA).

Dans ce but, des NP biocompatibles PLGA-Polyéthylène glycol (PEG) seront synthétisées et fonctionnalisées avec du bis-sulfone pour lier des fragments ciblant la surface. La synthèse implique l'activation du PLGA, la conjugaison PLGA-PEG, l'activation du bis-sulfone et la conjugaison PLGA-PEG-bis-sulfone. Le rapport PLGA/PEG sera ajusté en fonction de la charge utile hydrophobe/hydrophilie. La bis-sulfone est utilisée pour la PEGylation sélective et efficace de la liaison disulfure de la protéine ou pour conjuguer des protéines/peptides marqués His selon des méthodes standardisées pour mettre en œuvre soit un ciblage cellulaire spécifique, soit des agents antimicrobiens. La chromatographie liquide haute performance (HPLC) sera utilisée pour valider la réaction biosynthétique. La diffusion dynamique de la lumière (DLS), l'analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et la microscopie électronique à balayage (MEB) définiront les propriétés morphologiques et ultrastructurales de la construction finale. La résonance plasmonique de surface validera la reconnaissance de la cible. Ensuite, l’assemblage du composé hybride GelMA-NP sera réalisé par impression 3D par extrusion selon des pipelines de production standardisés. L'hydrogel et la suspension NP seront distribués via des buses séparées, selon des modèles 2D et 3D avec des tailles de caractéristiques de 100 à 1 000 nm, sous contrôle de pression et de température. Les concentrations scalaires de NP seront utilisées puis évaluées.

L'intégrité des NP et la dynamique de libération de celles-ci à partir de GelMA seront étudiées en immergeant les GelMA-NP chargées de composé fluorescent avec un milieu de croissance cellulaire biomimétique et en quantifiant les NP libérées dans le surnageant au cours d'expériences temporelles. La quantification NP sera effectuée à l'aide de la spectroscopie UV-Vis, de la spectroscopie de fluorescence ou du comptage de particules tel que le système NTA. L'intégrité des NP sera étudiée par microscopie électronique à transmission (TEM) et DLS.

Une fois les GelMA-NP caractérisées biochimiquement, celles-ci seront utilisées pour délivrer des composés bioactifs identifiés grâce aux données protéomiques, comme décrit ultérieurement.

Pour valider la bio-encre développée dans des modèles de maladies craniofaciales in vitro, les patients présentant des malformations craniofaciales subissant une chirurgie crânienne seront sélectionnés et inscrits dans l'étude. Plus précisément, les patients pédiatriques atteints de craniosténose et d'autres malformations innées, traumatismes ou tumeurs cérébrales subissant une chirurgie crânienne seront inscrits. Les patients adultes subissant une chirurgie cranio-faciale seront également sélectionnés et inscrits pour un traumatisme cranio-facial et des tumeurs. À cette fin, des échantillons de tissus osseux crâniens provenant de patients pédiatriques et adultes seront obtenus comme déchets chirurgicaux lors d'une craniectomie ou d'un remodelage de la voûte crânienne après obtention du consentement éclairé signé (par les parents dans le cas des enfants). Pour chaque patient, les déchets seront randomisés en trois aliquotes. Parmi ceux-ci, 1 aliquote sera collectée dans un milieu de croissance cellulaire pour ensemencement d'échantillons de tissu osseux dans une plaque de culture afin d'isoler les cellules stromales mésenchymateuses (CSM). Par la suite, le MSC sera étendu jusqu'au 3ème passage de culture et collecté dans des infrastructures de biobanques avec des données cliniques anonymisées associées et un système de suivi optimisé pour une analyse ultérieure comme suit. La libération et la biocompatibilité du bioink NP basé sur GelMA seront analysées à l'aide de MSC, au moyen d'essais fonctionnels pour : évaluer la dynamique d'adhésion focale et étudier l'adhésion cellulaire au bioink gélifié par test d'immunofluorescence. Le comportement et la viabilité des cellules seront mesurés au cours d'expériences temporelles à l'aide d'un système d'imagerie de cellules vivantes (systèmes d'analyse de cellules vivantes Incucyte).

De plus, 2 aliquotes d'échantillons de tissu osseux provenant de patients seront congelées dans de l'azote liquide (après l'avoir immergé dans un milieu cryoprotecteur avec des inhibiteurs de protéase). Les protéines et les métabolites seront isolés de ces échantillons à l'aide d'un protocole standardisé interne. Les échantillons extraits seront ensuite digérés à l'aide du protocole de digestion de préparation d'échantillons assistée par filtre (FASP). Ensuite, les échantillons seront analysés par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS). Les métabolites seront également évalués par LC-MS/MS et seront séparés par HPLC. Ensuite, les résultats obtenus sur les protéines et les métabolites seront analysés par analyse de voie intégrée (en utilisant l'IPA) pour réaliser le profilage multiomique de chaque patient, identifiant ainsi les cibles médicamenteuses à exploiter dans la conception de médicaments. Des outils informatiques de conception de médicaments, notamment l'amarrage moléculaire et le criblage virtuel, seront utilisés pour identifier les principaux composés des bases de données de médicaments/produits chimiques capables d'interagir avec les cibles sélectionnées à partir des ensembles de données de profils omiques intégrés. Le comportement dynamique, la stabilité et les interactions de liaison des complexes cible-ligand seront étudiés au moyen de simulations de dynamique moléculaire (MD) pour analyser les motifs de liaison et les points chauds. Les informations fournies par MD sur les interactions moléculaires guideront la conception et l’optimisation de nouveaux composés. Cela impliquera d'incorporer des modifications structurelles avec des approches basées sur les ligands et d'effectuer un criblage virtuel pour améliorer l'affinité de liaison, la sélectivité et la ressemblance avec un médicament. Les biomolécules identifiées grâce à ces études in silico seront ensuite achetées commercialement et encapsulées dans des NP PLGA. À cet égard, la nanoprécipitation et l’émulsion unique seront exploitées pour les charges utiles hydrophobes, tandis que la technique d’évaporation du solvant à double émulsion (w1/o/w2) sera utilisée pour les charges utiles hydrophiles. Ensuite, le PLGA délivrant les composés sélectionnés sera complexé dans une matrice d'hydrogel (GelMA). Les propriétés trophiques fonctionnelles et pro-régénératives du composé bioink délivrant des biomolécules seront évaluées dans le MSC pour tester les propriétés ostéogéniques - par le biais d'un test d'activité ALP, d'une coloration de minéralisation in vitro et d'une analyse de l'expression des gènes marqueurs. De plus, les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (gamme commerciale) seront traitées avec le complexe GelMA-NPs-médicament pour évaluer les propriétés angiogéniques en comptant et en dimensionnant les structures de type capillaire formées in vitro (test de formation de tubes).

De plus, une petite aliquote de sang veineux périphérique (2-3 ml pour les patients pédiatriques et jusqu'à 7 ml pour les patients adultes) provenant des examens cliniques de routine sera collectée. Les PBMC seront isolées d'un échantillon de sang total à l'aide de la technique de centrifugation sur gradient de densité Ficoll. Les cellules monocytes/macrophages seront ensuite séparées au moyen de billes magnétiques conjuguées à l'anticorps CD14 et cultivées in vitro avec des facteurs (c.-à-d. M-CSF, RANKL) pour former des ostéoclastes matures. Ceux-ci seront utilisés pour évaluer la bio-résorbabilité du composé GelMA-NP. En bref, les ostéoclastes seront ensemencés sur les surfaces à nanomotifs GelMA-NP et l'expression de marqueurs spécifiques aux ostéoclastes typiques sera évaluée par analyse d'immunofluorescence. Des tests SEM et immunofluorescence seront utilisés pour visualiser ultra-structurellement l'interface ostéoclaste-bioink et discriminer la résorption en deux et trois dimensions.

Les MSC/ostéoprogéniteurs et les ostéoclastes dérivés de patients seront également exploités pour obtenir une culture in vitro 2D et 3D afin d'imiter le microenvironnement biologique existant à la limite os-implant pour la validation du complexe bioink développé. Les composants du bioink seront soit bio-imprimés avec des cellules (c'est-à-dire des cellules délivrées via une buse indépendante) pour former des modèles chargés de cellules, soit imprimés sur la surface de croissance des récipients de culture cellulaire et laissés se gélifier avant l'ensemencement cellulaire, selon les objectifs de chaque test. La dynamique de libération du NP à partir du GelMA, la viabilité et la prolifération cellulaires, les effets angiogéniques et régénérateurs osseux seront évalués comme mentionné ci-dessus.

Pour tester ses effets antibactériens, le GelMA déchargé et le GelMA-NP seront imprimés sur des boîtes de Pétri et laissés se gélifier. Par la suite, il sera incubé avec les souches bactériennes opportunistes (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis et Pseudomonas aeruginosa) dans le bouillon de culture approprié pendant la nuit. L'adhésion et le nombre de bactéries seront évalués de manière comparative, en testant les effets liés à la dose et au temps. L'activité antibactérienne de GelMA-NP par rapport à GelMA sera également prise en charge par l'imagerie SEM.