Biotinta funcionalizada que proporciona biomoléculas para el tratamiento de enfermedades craneofaciales (DART-CRAFT)

Para desarrollar una matriz polimérica biosintética moldeable a base de colágeno, se modificarán bioquímicamente hidrogeles comerciales a base de gelatina-metacrilamida (GelMA) para ajustar con precisión su pseudoplasticidad y límite elástico, y se funcionalizarán para implementar la administración de fármacos para mejorar las propiedades biológicas. El GelMA se enriquecerá químicamente con: moléculas adhesivas (p. ej. compuestos inorgánicos que liberan iones o a base de alginato), si es necesario, para aumentar la adhesión a los materiales implantables utilizados en la reconstrucción craneofacial, fotoiniciadores sin escisión a base de tiol (p. ej. eosinaY combinada con trietanolamina y vinilcaprolactama) para permitir la reticulación activada por luz visible y minimizar los problemas de seguridad de la luz ultravioleta. La foto-reticulación se logrará mediante un dispositivo portátil de luz visible (420-480 nm) para inducir la gelificación de la biotinta. Las propiedades físicas (morfología, propiedades viscoelásticas, rigidez, resistencia a una tensión aplicada) de los diferentes compuestos GelMA se analizarán según procedimientos estandarizados. Las propiedades adhesivas de GelMA se medirán mediante pruebas de resistencia al corte en condiciones secas. Una vez identificados los compuestos GelMA que muestran las características biológicas más altas, se dotarán de nanopartículas (NP) basadas en poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) funcionalizadas.

Para este objetivo, se sintetizarán y funcionalizarán NP biocompatibles de PLGA-polietilenglicol (PEG) con bissulfona para unir restos objetivo en la superficie. La síntesis implica activación de PLGA, conjugación de PLGA-PEG, activación de bis-sulfona y conjugación de PLGA-PEG-bis-sulfona. La relación PLGA/PEG se ajustará según la carga útil de hidrofobicidad/hidrofilicidad. La bissulfona se utiliza para la PEGilación selectiva y eficiente del enlace disulfuro de proteínas o para conjugar proteínas/péptidos etiquetados con His de acuerdo con métodos estandarizados para implementar agentes antimicrobianos o dirigidos a células específicas. Se utilizará cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para validar la reacción biosintética. La dispersión dinámica de la luz (DLS), el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y la microscopía electrónica de barrido (SEM) definirán las propiedades morfológicas y ultraestructurales de la construcción final. La resonancia de plasmón superficial validará el reconocimiento del objetivo. Luego, el ensamblaje del compuesto híbrido GelMA-NP se logrará mediante impresión 3D por extrusión de acuerdo con procesos de producción estandarizados. El hidrogel y la suspensión NP se dispensarán a través de boquillas separadas, en patrones 2D y 3D con tamaños de características de 100-1000 nm, bajo control de presión y temperatura. Se utilizarán concentraciones escalares de NP y luego se evaluarán.

La integridad de las NP y la dinámica de liberación de estas de GelMA se estudiarán sumergiendo las GelMA-NP cargadas con un compuesto fluorescente en un medio de crecimiento celular biomimético y cuantificando las NP liberadas en el sobrenadante en experimentos de curso temporal. La cuantificación de NP se realizará mediante espectroscopia UV-Vis, espectroscopia de fluorescencia o recuento de partículas como el sistema NTA. La integridad de las NP se estudiará con microscopía electrónica de transmisión (TEM) y DLS.

Una vez caracterizados bioquímicamente los GelMA-NP, se utilizarán para administrar compuestos bioactivos identificados a través de datos proteómicos como se describe posteriormente.

Para validar la biotinta desarrollada en modelos de enfermedades craneofaciales in vitro, se seleccionarán e inscribirán en el estudio pacientes con malformaciones craneofaciales sometidos a cirugía craneal. En concreto, se inscribirán pacientes pediátricos afectados por craneosinostosis y otros defectos congénitos, traumatismos o tumores cerebrales sometidos a cirugía craneal. Los pacientes adultos sometidos a cirugía craneofacial también serán seleccionados e inscritos para tumores y traumatismos craneofaciales. Para ello, se obtendrán muestras de tejido óseo craneal derivadas de pacientes tanto pediátricos como adultos como desechos quirúrgicos durante la craniectomía o remodelación de la bóveda craneal previa obtención del consentimiento informado firmado (por los padres en el caso de niños). Para cada paciente, los tejidos de desecho se distribuirán al azar en tres alícuotas. De estos, se recolectará 1 alícuota en medio de crecimiento celular para sembrar muestras de tejido óseo en una placa de cultivo para aislar células del estroma mesenquimatoso (MSC). A partir de entonces, MSC se ampliará hasta el tercer pase de cultivo y se recopilará en infraestructuras de biobancos con datos clínicos anonimizados asociados y un sistema de seguimiento optimizado para análisis posteriores de la siguiente manera. La liberación y biocompatibilidad de NP de biotinta basada en GelMA se analizarán utilizando MSC, a través de ensayos funcionales para: evaluar la dinámica de adhesión focal y estudiar la adhesión celular a la biotinta gelificada mediante ensayo de inmunofluorescencia. El comportamiento y la viabilidad de las células se medirán en experimentos a lo largo del tiempo utilizando un sistema de imágenes de células vivas (sistemas de análisis de células vivas Incucyte).

Además, se congelarán 2 alícuotas de muestras de tejido óseo obtenidas de pacientes en nitrógeno líquido (después de sumergirlas en un medio crioprotector con inhibidores de proteasa). Las proteínas y los metabolitos se aislarán de estas muestras utilizando un protocolo estandarizado interno. Las muestras extraídas se digerirán utilizando el protocolo de digestión de preparación de muestras asistida por filtro (FASP). Luego, las muestras se analizarán mediante espectrometría de masas en tándem por cromatografía líquida (LC-MS/MS). También los metabolitos se evaluarán mediante LC-MS/MS y se separarán mediante HPLC. Luego, los resultados obtenidos sobre proteínas y metabolitos se analizarán mediante análisis de vías integradas (utilizando IPA) para lograr el perfil multiómico de cada paciente, identificando así objetivos farmacológicos que se explotarán en el diseño de fármacos. Se emplearán herramientas computacionales de diseño de fármacos, incluido el acoplamiento molecular y la detección virtual, para identificar los compuestos principales de las bases de datos de fármacos/químicos capaces de interactuar con los objetivos seleccionados de los conjuntos de datos de perfiles ómicos integrados. El comportamiento dinámico, la estabilidad y las interacciones de unión de los complejos objetivo-ligando se estudiarán mediante simulaciones de dinámica molecular (MD) para analizar motivos de unión y puntos críticos. Los conocimientos aportados por los médicos sobre las interacciones moleculares guiarán el diseño y la optimización de nuevos compuestos. Esto implicará incorporar modificaciones estructurales con enfoques basados ​​en ligandos y realizar un cribado virtual para mejorar la afinidad de unión, la selectividad y la similitud con los fármacos. Las biomoléculas identificadas a través de estos estudios in silico se comprarán comercialmente y se encapsularán en PLGA NP. En este sentido, se aprovechará la nanoprecipitación y la emulsión única para cargas hidrófobas, mientras que para las cargas hidrófilas se empleará la técnica de evaporación de disolventes en doble emulsión (w1/o/w2). Después, el PLGA que suministra los compuestos seleccionados se complejará en una matriz de hidrogel (GelMA). Las propiedades funcionales tróficas y proregenerativas del compuesto de biotinta que libera biomoléculas se evaluarán en MSC para probar las propiedades osteogénicas, mediante un ensayo de actividad ALP, tinción de mineralización in vitro y análisis de expresión de genes marcadores. Además, las células endoteliales de la vena umbilical humana (línea comercial) se tratarán con el complejo de fármaco GelMA-NP para evaluar las propiedades angiogénicas mediante el conteo y el tamaño de las estructuras similares a capilares formadas in vitro (ensayo de formación de tubos).

Además, se recolectará una pequeña alícuota de sangre venosa periférica (2-3 ml para pacientes pediátricos y hasta 7 ml para pacientes adultos) de exámenes clínicos de rutina. Las PBMC se aislarán de una muestra de sangre completa utilizando la técnica de centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll. Luego, las células de monocitos/macrófagos se separarán mediante perlas magnéticas conjugadas con anticuerpo CD14 y se cultivarán in vitro con factores (es decir, M-CSF, RANKL) para formar osteoclastos maduros. Estos se utilizarán para evaluar la biorreabsorbibilidad del compuesto GelMA-NP. Brevemente, se sembrarán osteoclastos en las superficies con nanopatrones GelMA-NP y se evaluará la expresión de marcadores típicos específicos de osteoclastos mediante análisis de inmunofluorescencia. Se utilizará SEM y ensayo de inmunofluorescencia para visualizar ultraestructuralmente la interfaz osteoclasto-biotinta y discriminar la resorción en dos y tres dimensiones.

También se explotarán MSC/osteoprogenitores y osteoclastos derivados de pacientes para obtener cultivos in vitro 2D y 3D para imitar el microambiente biológico existente en el límite hueso-implante para la validación del complejo de biotinta desarrollado. Los componentes de la biotinta se bioimprimirán con células (es decir, células administradas a través de una boquilla independiente) para formar modelos cargados de células, o se imprimirán en la superficie de crecimiento de los recipientes de cultivo celular y se dejarán jelificar antes de la siembra celular, según los objetivos de cada prueba. La dinámica de liberación de NP de GelMA, la viabilidad y proliferación celular, los efectos angiogénicos y regenerativos óseos se evaluarán como se mencionó anteriormente.

Para probar sus efectos antibacterianos, tanto el GelMA descargado como el GelMA-NP se imprimirán en placas de Petri y se dejarán jelificar. Posteriormente se incubará con cepas bacterianas oportunistas (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis y Pseudomonas aeruginosa) en el caldo de cultivo apropiado durante la noche. La adhesión y el recuento bacteriano se evaluarán comparativamente, probando los efectos relacionados con la dosis y el tiempo. La actividad antibacteriana de GelMA-NP sobre GelMA también estará respaldada por imágenes SEM.