두개안면 질환 치료를 위한 생체분자를 전달하는 기능화된 바이오잉크 (DART-CRAFT)

성형 가능한 생합성 콜라겐 기반 폴리머 매트릭스를 개발하기 위해 상업용 젤라틴-메타크릴아미드(GelMA) 기반 하이드로겔은 생화학적으로 변형되어 유사 가소성과 항복 응력을 미세 조정하고 향상된 생물학적 특성을 위한 약물 전달을 구현하도록 기능화됩니다. GelMA는 화학적으로 다음과 같은 물질로 풍부해집니다: 접착 분자(예: 알긴산 기반 또는 이온 방출 무기 화합물), 필요한 경우 두개안면 재건에 사용되는 이식 가능한 재료에 대한 접착력을 높이기 위해 티올 기반 비절단형 광개시제(예: eosinY는 트리에탄올아민 및 비닐 카프로락탐과 결합되어 가시광선 활성화 가교를 가능하게 하고 UV 광선의 안전 문제를 최소화합니다. 사진 가교는 바이오잉크의 젤리화를 유도하기 위해 휴대용 가시광선 장치(420-480 nm)를 통해 달성됩니다. 다양한 GelMA 화합물의 물리적 특성(형태학, 점탄성 특성, 강성, 적용된 응력에 대한 저항성)은 표준화된 절차에 따라 분석됩니다. GelMA의 접착 특성은 건조 조건에서 랩 전단 강도 테스트로 측정됩니다. 가장 높은 생물학적 특징을 나타내는 GelMA 화합물이 확인되면 기능화된 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 기반 나노입자(NP)가 부여됩니다.

이 목적을 위해 생체적합성 PLGA-폴리에틸렌 글리콜(PEG) NP가 합성되고 표면의 표적 부분 결합을 위해 비스술폰으로 기능화됩니다. 합성에는 PLGA 활성화, PLGA-PEG 접합, 비스술폰 활성화 및 PLGA-PEG-비스술폰 접합이 포함됩니다. PLGA/PEG 비율은 소수성/친수성 페이로드에 맞게 조정됩니다. 비스술폰은 단백질의 이황화 결합을 선택적이고 효율적으로 PEG화하거나 특정 세포 표적화 또는 항균제를 구현하기 위한 표준화된 방법에 따라 His 태그가 붙은 단백질/펩타이드를 접합시키는 데 사용됩니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 생합성 반응을 검증합니다. 동적 광산란(DLS), 나노입자 추적 분석(NTA) 및 주사 전자 현미경(SEM)은 최종 구조물의 형태학적 및 미세구조적 특성을 정의합니다. 표면 플라즈몬 공명은 표적 인식을 검증합니다. 그런 다음 표준화된 생산 파이프라인에 따라 압출 3D 프린팅을 통해 GelMA-NP 하이브리드 복합 조립이 달성됩니다. 하이드로겔과 NP 현탁액은 압력 및 온도 제어 하에 100-1000 nm 피처 크기의 2D 및 3D 패턴으로 별도의 노즐을 통해 분배됩니다. 스칼라 NP 농도가 사용된 후 평가됩니다.

GelMA에서 이들의 NP 무결성 및 방출 역학은 형광 화합물이 포함된 GelMA-NP를 생체 모방 세포 성장 배지에 담그고 시간 경과 실험에서 상층액에서 방출된 NP를 정량화하여 연구됩니다. NP 정량화는 UV-Vis 분광학, 형광 분광학 또는 NTA 시스템과 같은 입자 계수를 사용하여 수행됩니다. NP 무결성은 투과전자현미경(TEM)과 DLS를 사용하여 연구됩니다.

GelMA-NP를 생화학적으로 특성화한 후에는 이후에 설명된 대로 프로테오믹스 데이터를 통해 식별된 생리 활성 화합물을 전달하는 데 사용됩니다.

시험관 내 두개안면 질환 모델에서 개발된 바이오잉크를 검증하기 위해 두개골 수술을 받는 두개안면 기형 환자가 선택되어 연구에 등록됩니다. 구체적으로, 두개골조기유합증 및 기타 선천적 결함, 외상 또는 두개골 수술을 받는 뇌종양의 영향을 받는 소아 환자가 등록됩니다. 두개안면 수술을 받는 성인 환자도 선택되어 두개안면 외상 및 종양에 등록됩니다. 이를 위해 소아 및 성인 환자 모두에게서 추출한 두개골 뼈 조직 표본은 서명된 사전 동의(어린이의 경우 부모)를 얻은 후 두개골 절제술 또는 두개골 저장소 리모델링 중에 수술 폐기물로 확보됩니다. 각 환자에 대해 폐기물 조직은 무작위로 3개의 분취량으로 분류됩니다. 이 중 중간엽 간질 세포(MSC)를 분리하기 위해 뼈 조직 샘플을 배양 플레이트에 파종하기 위해 세포 성장 배지에 1개의 분취량이 수집됩니다. 이후 MSC는 3차 배양 계대까지 확장되어 다음과 같이 후속 분석을 위해 관련 익명화된 임상 데이터 및 최적화된 추적 시스템과 함께 바이오뱅킹 인프라에 수집됩니다. GelMA 기반 바이오잉크 NP 방출 및 생체 적합성은 기능적 분석을 통해 MSC를 사용하여 분석됩니다. 초점 접착 역학을 평가하고 면역형광 분석을 통해 겔화된 바이오잉크에 대한 세포 접착을 연구합니다. 세포 거동 및 생존력은 살아있는 세포 이미징 시스템(Incucyte Live Cells Analysis 시스템)을 사용하여 시간 경과 실험에서 측정됩니다.

또한 환자 유래 뼈 조직 표본 2개를 액체 질소에 급속 냉동합니다(프로테아제 억제제가 포함된 냉동 보호 배지에 담근 후). 단백질과 대사산물은 사내 표준화된 프로토콜을 사용하여 이러한 샘플에서 분리됩니다. 추출된 샘플은 FASP(여과 샘플 준비) 소화 프로토콜을 사용하여 소화됩니다. 그런 다음 샘플은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)으로 분석됩니다. 또한 대사산물은 LC-MS/MS로 평가하고 HPLC로 분리합니다. 그런 다음, 단백질 및 대사산물에 대해 얻은 결과는 통합 경로 분석(IPA 사용)을 통해 분석되어 각 환자의 다중 프로파일링을 달성하여 약물 설계에 활용될 약물 가능 표적을 식별합니다. 분자 도킹 및 가상 스크리닝을 포함한 전산 약물 설계 도구를 사용하여 통합 오믹 프로파일 데이터세트에서 선택한 표적과 상호 작용할 수 있는 약물/화학 데이터베이스의 주요 화합물을 식별합니다. 결합 모티프와 핫스팟을 분석하기 위해 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 통해 표적-리간드 복합체의 동적 거동, 안정성 및 결합 상호 작용을 연구합니다. 분자 상호 작용에 대한 MD 정보의 통찰력은 새로운 화합물의 설계 및 최적화를 안내할 것입니다. 여기에는 리간드 기반 접근법으로 구조적 변형을 통합하고 가상 스크리닝을 수행하여 결합 친화성, 선택성 및 약물 유사성을 향상시키는 것이 포함됩니다. 이러한 in silico 연구를 통해 확인된 생체분자는 상업적으로 구매되어 PLGA NP에 캡슐화됩니다. 이와 관련하여 소수성 페이로드에는 나노침전 및 단일 에멀젼이 활용되고, 친수성 페이로드에는 이중 에멀젼 용매 증발 기술(w1/o/w2)이 사용됩니다. 그 후, 선택된 화합물을 전달하는 PLGA는 하이드로겔(GelMA) 매트릭스로 복합체화됩니다. 생체분자를 전달하는 바이오잉크 화합물의 기능적 영양 및 재생 촉진 특성을 MSC에서 평가하여 ALP 활성 분석, 시험관 내 광물화 염색 및 마커 유전자 발현 분석을 통해 골형성 특성을 테스트합니다. 또한, 인간 제대 정맥 내피 세포(상용 라인)를 GelMA-NPs-약물 복합체로 처리하여 시험관 내에서 형성된 모세혈관 유사 구조를 계산하고 크기를 조정하여 혈관 신생 특성을 평가합니다(관 형성 분석).

또한, 일상적인 임상 검사에서 소량의 말초 정맥혈(소아 환자의 경우 2~3ml, 성인 환자의 경우 최대 7ml)이 수집됩니다. PBMC는 Ficoll 밀도 구배 원심분리 기술을 사용하여 전혈 샘플에서 분리됩니다. 단핵구/대식세포는 CD14 항체가 결합된 자기 비드를 통해 분리되고 인자(예: M-CSF, RANKL)을 사용하여 성숙한 파골세포를 형성합니다. 이는 GelMA-NP 화합물의 생체흡수성을 평가하는 데 사용됩니다. 간략하게, 파골세포는 GelMA-NP 나노패턴 표면에 시드되고 일반적인 파골세포 특이적 마커의 발현은 면역형광 분석을 통해 평가됩니다. SEM 및 면역형광 분석법을 사용하여 파골세포-바이오잉크 경계면을 초구조적으로 시각화하고 재흡수를 2차원 및 3차원적으로 식별합니다.

환자로부터 유래된 MSC/골조생체 및 파골세포는 또한 개발된 바이오잉크 복합체의 검증을 위해 뼈-임플란트 경계에 존재하는 생물학적 미세 환경을 모방하기 위해 2D 및 3D 체외 배양을 얻기 위해 활용될 것입니다. 바이오잉크 구성 요소는 세포가 포함된 모델을 형성하기 위해 세포(즉, 독립 노즐을 통해 전달된 세포)로 바이오프린팅되거나, 각 테스트의 목적에 따라 세포 배양 용기의 성장 표면에 인쇄되어 세포 파종 전에 젤리화됩니다. GelMA로부터의 NP의 방출 역학, 세포 생존력 및 증식, 혈관 신생 및 뼈 재생 효과는 위에서 언급한 대로 평가됩니다.

항균 효과를 테스트하기 위해 언로드된 GelMA와 GelMA-NP는 모두 페트리 접시에 인쇄되어 젤리화됩니다. 그 후 기회감염 박테리아 균주(E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis 및 Pseudomonas aeruginosa)를 적절한 배양액에 밤새 담가두었습니다. 박테리아 부착 및 수를 비교 평가하여 용량 및 시간 관련 효과를 테스트합니다. GelMA에 대한 GelMA-NP의 항균 활성은 SEM 이미징으로도 뒷받침됩니다.