Toiminnallisia Bioink-biomolekyylejä kraniofacial-sairauksien hoitoon (DART-CRAFT)

Muovattavan biosynteettisen kollageenipohjaisen polymeerimatriisin kehittämiseksi kaupalliset gelatiini-metakryyliamidi (GelMA) -pohjaiset hydrogeelit modifioidaan biokemiallisesti hienosäätämään niiden pseudoplastisuutta ja myötörajaa, ja funktionalisoidaan toteuttamaan lääkkeen annostelu parantaa biologisia ominaisuuksia. GelMA on kemiallisesti rikastettu: liimamolekyylejä (esim. alginaattipohjaisia ​​tai ioneja vapauttavia epäorgaanisia yhdisteitä) tarvittaessa lisäämään tarttumista kallon kasvojen rekonstruktiossa käytettäviin implantoitaviin materiaaleihin, tiolipohjaiset ei-halkaisutyyppiset fotoinitiaattorit (esim. eosiini yhdistettynä trietanoliamiiniin ja vinyylikaprolaktaamiin) mahdollistaa näkyvän valon aktivoiman silloittumisen ja minimoi UV-valon turvallisuusongelmat. Valosilloitus saadaan aikaan kannettavalla näkyvän valon laitteella (420-480 nm), joka saa aikaan biomusteen hyytelöinnin. Eri GelMA-yhdisteiden fysikaaliset ominaisuudet (morfologia, viskoelastiset ominaisuudet, jäykkyys, rasituskestävyys) analysoidaan standardoitujen menetelmien mukaisesti. GelMA:n tartunta-ominaisuudet mitataan lävistysleikkauslujuustesteillä kuivissa olosuhteissa. Kun on tunnistettu GelMA-yhdisteet, joilla on korkeimmat biologiset ominaisuudet, niillä on funktionalisoituja poly- (maito-ko-glykolihappo) (PLGA) -pohjaisia ​​nanopartikkeleita (NP).

Tätä tarkoitusta varten syntetisoidaan ja funktionalisoidaan bioyhteensopivia PLGA-polyetyleeniglykolin (PEG) NP:itä bis-sulfonilla pinnalla olevien kohderyhmien sitomiseksi. Synteesi sisältää PLGA-aktivoinnin, PLGA-PEG-konjugoinnin, bis-sulfoniaktivoinnin ja PLGA-PEG-bis-sulfonikonjugoinnin. PLGA/PEG-suhdetta säädetään hydrofobisuuden/hydrofiilisyyden hyötykuorman mukaan. Bis-sulfonia käytetään proteiinin disulfidisidoksen selektiiviseen ja tehokkaaseen PEGylaatioon tai His-merkittyjen proteiinien/peptidien konjugoimiseen standardoitujen menetelmien mukaisesti joko spesifisen solukohdistuksen tai antimikrobisten aineiden toteuttamiseksi. Korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) käytetään biosynteettisen reaktion validointiin. Dynaaminen valonsironta (DLS), nanohiukkasten seurantaanalyysi (NTA) ja pyyhkäisyelektronimikroskooppi (SEM) määrittelevät lopullisen rakenteen morfologiset ja ultrarakenteelliset ominaisuudet. Surface Plasmon Resonance vahvistaa kohteen tunnistuksen. Sitten GelMA-NP-hybridiyhdisteen kokoonpano toteutetaan ekstruusio-3D-tulostuksen avulla standardoitujen tuotantoputkien mukaisesti. Hydrogeeli ja NP-suspensio annostellaan erillisten suuttimien kautta, 2D- ja 3D-kuvioissa 100-1000 nm:n ominaisuuskoolla, paineen ja lämpötilan hallinnassa. Skalaari-NP-konsentraatioita käytetään ja sitten arvioidaan.

NP:n eheyttä ja niiden vapautumisdynamiikkaa GelMA:sta tutkitaan upottamalla fluoresoivalla yhdisteellä ladatut GelMA-NP:t biomimeettiseen solukasvualustaan ​​ja kvantifioimalla supernatantissa vapautuneet NP:t ajankulun kokeissa. NP-kvantifiointi suoritetaan käyttämällä UV-Vis-spektroskopiaa, fluoresenssispektroskopiaa tai partikkelien laskemista, kuten NTA-järjestelmää. NP:iden eheyttä tutkitaan transmissioelektronimikroskoopilla (TEM) ja DLS:llä.

Kun GelMA-NP:t on biokemiallisesti karakterisoitu, niitä käytetään toimittamaan bioaktiivisia yhdisteitä, jotka on tunnistettu proteomiikkatietojen perusteella myöhemmin kuvatulla tavalla.

Kehitetyn biomusteen validoimiseksi in vitro kallon kasvosairauksien malleissa valitaan ja otetaan mukaan tutkimukseen potilaita, joilla on kallon kasvojen epämuodostumia ja joille tehdään kalloleikkaus. Erityisesti mukaan otetaan lapsipotilaat, joilla on kraniosynostoos ja muut synnynnäiset vauriot, vammat tai aivokasvaimet, joille tehdään kalloleikkaus. Aikuiset potilaat, joille tehdään kallo-kasvoleikkaus, valitaan ja otetaan mukaan myös kasvojen vamman ja kasvainten vuoksi. Tätä tarkoitusta varten sekä lapsi- että aikuispotilailta saatuja kallon luukudosnäytteitä otetaan kirurgisen jätteenä kallonpoiston tai kallon holvin uudelleenmuotoilun yhteydessä, kun on saatu allekirjoitettu tietoinen suostumus (lasten tapauksessa vanhemmilta). Jokaisen potilaan jätekudokset satunnaistetaan kolmeen osaan. Näistä 1 alikvootti kerätään solujen kasvualustaan ​​luukudosnäytteiden istuttamiseksi viljelylevylle mesenkymaalisten stroomasolujen (MSC) eristämiseksi. Sen jälkeen MSC laajennetaan 3. viljelyjaksoon asti ja kerätään biopankkiinfrastruktuureihin ja niihin liittyvät anonymisoidut kliiniset tiedot ja optimoitu seurantajärjestelmä myöhempää analyysiä varten seuraavasti. GelMA-pohjainen biomusteen NP:n vapautuminen ja biologinen yhteensopivuus analysoidaan MSC:llä funktionaalisilla määrityksillä, jotta voidaan arvioida fokaalin adheesion dynamiikkaa ja tutkia solujen adheesiota geeliytyneeseen biomusteeseen immunofluoresenssimäärityksellä. Solujen käyttäytymistä ja elinkelpoisuutta mitataan aikakulun kokeissa käyttämällä elävien solujen kuvantamisjärjestelmää (Incucyte Live Cells Analysis Systems).

Lisäksi 2 alikvoottia potilaista peräisin olevia luukudosnäytteitä pikapakastetaan nestetypessä (sen jälkeen, kun se on upotettu kylmältä suojaavaan alustaan, jossa on proteaasi-inhibiittoreita). Proteiinit ja metaboliitit eristetään näistä näytteistä käyttämällä talon standardisoitua protokollaa. Uutetut näytteet pilkotaan sitten käyttämällä suodatusavusteista näytevalmistetta (FASP) -hajotusprotokollaa. Sitten näytteet analysoidaan nestekromatografialla tandem-massaspektrometrialla (LC-MS/MS). Myös metaboliitit arvioidaan LC-MS/MS:llä ja erotetaan HPLC:llä. Sen jälkeen proteiineista ja metaboliiteista saadut tulokset analysoidaan integroidulla reittianalyysillä (IPA:ta käyttäen), jotta saavutetaan kunkin potilaan multiominen profilointi, mikä tunnistaa lääkkeiden suunnittelussa hyödynnettävät lääkkeet. Laskennallisia lääkesuunnittelutyökaluja, mukaan lukien molekyylitelakka ja virtuaalinen seulonta, käytetään lyijyyhdisteiden tunnistamiseen lääke-/kemiallisista tietokannoista, jotka pystyvät olemaan vuorovaikutuksessa valittujen kohteiden kanssa integroiduista omic-profiilitietosarjoista. Kohde-ligandikompleksien dynaamista käyttäytymistä, stabiilisuutta ja sitoutumisvuorovaikutuksia tutkitaan Molecular Dynamics (MD) -simulaatioiden avulla sitoutumismotiivien ja hotspottien analysoimiseksi. MD-tietoiset oivallukset molekyylien vuorovaikutuksista ohjaavat uusien yhdisteiden suunnittelua ja optimointia. Tämä edellyttää rakenteellisten muutosten sisällyttämistä ligandipohjaisiin lähestymistapoihin ja virtuaalisen seulonnan suorittamista sitoutumisaffiniteetin, selektiivisyyden ja lääkkeen kaltaisuuden parantamiseksi. Näillä in silico -tutkimuksilla tunnistetut biomolekyylit ostetaan sitten kaupallisesti ja kapseloidaan PLGA NP:ihin. Tässä suhteessa nanosaostusta ja yksittäisemulsiota hyödynnetään hydrofobisissa hyötykuormissa, kun taas kaksoisemulsion liuotinhaihdutustekniikkaa (w1/o/w2) käytetään hydrofiilisiin hyötykuormiin. Sen jälkeen valittuja yhdisteitä kuljettava PLGA kompleksoidaan hydrogeeli- (GelMA) -matriisiin. Biomolekyylejä kuljettavan biomusteyhdisteen toiminnalliset troofiset ja pro-regeneratiiviset ominaisuudet arvioidaan MSC:ssä osteogeenisten ominaisuuksien testaamiseksi - ALP-aktiivisuusmäärityksellä, in vitro mineralisaatiovärjäyksellä ja markkerigeeniekspressioanalyysillä. Lisäksi ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (kaupallinen linja) käsitellään GelMA-NPs-lääkekompleksilla angiogeenisten ominaisuuksien arvioimiseksi laskemalla ja mitoittamalla in vitro muodostuneet kapillaarimaiset rakenteet (putken muodostusmääritys).

Lisäksi kerätään pieni määrä perifeeristä laskimoverta (2-3 ml lapsipotilaille ja enintään 7 ml aikuispotilaille) rutiinikliinisistä tutkimuksista. PBMC:t eristetään kokoverinäytteestä käyttämällä Ficoll-tiheysgradienttisentrifugointitekniikkaa. Monosyytti/makrofagisolut erotetaan sitten CD14-vasta-ainekonjugoitujen magneettihelmien avulla ja viljellään in vitro tekijöiden (esim. M-CSF, RANKL) kypsien osteoklastien muodostamiseksi. Näitä käytetään arvioitaessa GelMA-NP-yhdisteen bioresorboituvuutta. Lyhyesti sanottuna osteoklastit kylvetään GelMA-NP-nanokuvioiduille pinnoille ja tyypillisten osteoklastispesifisten markkerien ilmentyminen arvioidaan immunofluoresenssianalyysin avulla. SEM- ja immunofluoresenssimääritystä käytetään visualisoimaan ultrarakenteellisesti osteoklasti-biomusteen rajapinta ja erottamaan resorptio kaksi- ja kolmiulotteisesti.

Potilaista peräisin olevia MSC/osteoprogenitoreja ja osteoklasteja hyödynnetään myös 2D- ja 3D-in vitro -viljelmän saamiseksi, jotta voidaan jäljitellä luu-implanttirajalla olevaa biologista mikroympäristöä kehitetyn biomustekompleksin validoimiseksi. Biomusteen komponentit joko bioprintoidaan soluilla (eli itsenäisen suuttimen kautta toimitetuilla soluilla) solukuormitettujen mallien muodostamiseksi tai tulostetaan soluviljelyastioiden kasvupinnalle ja annetaan hyyteltyä ennen solujen kylvöä kunkin testin tavoitteiden mukaisesti. NP:n vapautumisdynamiikka GelMA:sta, solujen elinkelpoisuus ja proliferaatio, angiogeeniset ja luun regeneratiiviset vaikutukset arvioidaan edellä mainitulla tavalla.

Sen antibakteeristen vaikutusten testaamiseksi sekä tyhjä GelMA että GelMA-NP tulostetaan petrimaljoille ja annetaan hyyteltyä. Sen jälkeen sitä inkuboidaan opportunististen bakteerikantojen kanssa (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis ja Pseudomonas aeruginosa) sopivassa viljelyliemessä yön yli. Bakteerien adheesiota ja lukumäärää arvioidaan vertailevasti testaten annos- ja aikariippuvaisia ​​vaikutuksia. GelMA-NP:n antibakteerista vaikutusta GelMA:han verrattuna tuetaan myös SEM-kuvauksella.