Funktionalisierter Bioink, der Biomoleküle zur Behandlung kraniofazialer Erkrankungen liefert (DART-CRAFT)

Um eine formbare biosynthetische Polymermatrix auf Kollagenbasis zu entwickeln, werden kommerzielle Hydrogele auf Gelatine-Methacrylamid-Basis (GelMA) biochemisch modifiziert, um ihre Pseudoplastizität und Streckgrenze genau abzustimmen, und funktionalisiert, um die Wirkstoffabgabe für verbesserte biologische Eigenschaften zu implementieren. Das GelMA wird chemisch angereichert mit: Klebstoffmolekülen (z. B. alginatbasierte oder ionenfreisetzende anorganische Verbindungen), falls erforderlich, um die Haftung an implantierbaren Materialien zu erhöhen, die bei der kraniofazialen Rekonstruktion verwendet werden, thiolbasierte, nicht spaltbare Photoinitiatoren (z. B. EosinY kombiniert mit Triethanolamin und Vinylcaprolactam), um eine durch sichtbares Licht aktivierte Vernetzung zu ermöglichen und die Sicherheitsbedenken von UV-Licht zu minimieren. Die Photovernetzung wird durch ein tragbares Gerät mit sichtbarem Licht (420–480 nm) erreicht, um die Gelierung der Biotinte zu induzieren. Die physikalischen Eigenschaften (Morphologie, viskoelastische Eigenschaften, Steifigkeit, Widerstandsfähigkeit gegenüber einer aufgebrachten Belastung) der verschiedenen GelMA-Verbindungen werden nach standardisierten Verfahren analysiert. Die Klebeeigenschaften des GelMA werden durch Zugscherfestigkeitstests unter trockenen Bedingungen gemessen. Sobald GelMA-Verbindungen identifiziert wurden, die die höchsten biologischen Eigenschaften aufweisen, werden diese mit funktionalisierten Nanopartikeln (NPs) auf der Basis von Poly(milchsäure-glykolsäure) (PLGA) ausgestattet.

Zu diesem Zweck werden biokompatible PLGA-Polyethylenglykol (PEG)-NPs synthetisiert und mit Bissulfon funktionalisiert, um Targeting-Einheiten auf der Oberfläche zu binden. Die Synthese umfasst PLGA-Aktivierung, PLGA-PEG-Konjugation, Bis-Sulfon-Aktivierung und PLGA-PEG-Bis-Sulfon-Konjugation. Das PLGA/PEG-Verhältnis wird an die Hydrophobie/Hydrophilie-Nutzlast angepasst. Bissulfon wird zur selektiven und effizienten PEGylierung der Disulfidbindung von Proteinen oder zur Konjugation von His-markierten Proteinen/Peptiden nach standardisierten Methoden verwendet, um entweder spezifisches Zell-Targeting oder antimikrobielle Wirkstoffe zu implementieren. Zur Validierung der Biosynthesereaktion wird Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt. Dynamische Lichtstreuung (DLS), Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) werden die morphologischen und ultrastrukturellen Eigenschaften des endgültigen Konstrukts definieren. Die Oberflächenplasmonenresonanz validiert die Zielerkennung. Anschließend wird die Montage der GelMA-NP-Hybridmischung durch Extrusions-3D-Druck gemäß standardisierten Produktionspipelines erreicht. Das Hydrogel und die NP-Suspension werden über separate Düsen in 2D- und 3D-Mustern mit Strukturgrößen von 100–1000 nm unter Druck- und Temperaturkontrolle abgegeben. Skalare NP-Konzentrationen werden verwendet und dann ausgewertet.

Die NP-Integrität und die Freisetzungsdynamik dieser NPs aus GelMA werden untersucht, indem die mit fluoreszierender Verbindung beladenen GelMA-NPs in ein biomimetisches Zellwachstumsmedium getaucht werden und die im Überstand freigesetzten NPs in Zeitverlaufsexperimenten quantifiziert werden. Die NP-Quantifizierung wird mittels UV-Vis-Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie oder Partikelzählung wie dem NTA-System durchgeführt. Die Integrität der NPs wird mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und DLS untersucht.

Sobald die GelMA-NPs biochemisch charakterisiert sind, werden diese zur Bereitstellung bioaktiver Verbindungen verwendet, die anhand von Proteomikdaten identifiziert werden, wie nachfolgend beschrieben.

Um die entwickelte Bio-Tinte in In-vitro-Modellen kraniofazialer Erkrankungen zu validieren, werden Patienten mit kraniofazialen Fehlbildungen, die sich einer Schädeloperation unterziehen, ausgewählt und in die Studie aufgenommen. Insbesondere werden pädiatrische Patienten mit Kraniosynostose und anderen angeborenen Defekten, Traumata oder Hirntumoren, die sich einer Schädeloperation unterziehen, aufgenommen. Erwachsene Patienten, die sich einer kraniofazialen Operation unterziehen, werden ebenfalls ausgewählt und wegen kraniofazialer Traumata und Tumoren aufgenommen. Zu diesem Zweck werden Schädelknochengewebeproben, die sowohl von pädiatrischen als auch von erwachsenen Patienten stammen, als chirurgischer Abfall während der Kraniektomie oder des Umbaus des Schädelgewölbes nach Erhalt der unterschriebenen Einverständniserklärung (von den Eltern bei Kindern) entnommen. Für jeden Patienten werden die Abfallgewebe randomisiert in drei Aliquots aufgeteilt. Davon wird 1 Aliquot in Zellwachstumsmedium gesammelt, um Knochengewebeproben in Kulturplatten auszusäen, um mesenchymale Stromazellen (MSCs) zu isolieren. Danach wird MSC bis zur 3. Kulturpassage erweitert und in Biobanking-Infrastrukturen mit zugehörigen anonymisierten klinischen Daten und einem optimierten Trackingsystem für die nachfolgende Analyse wie folgt gesammelt. Die NP-Freisetzung und Biokompatibilität von GelMA-basiertem Bioink wird mittels MSC durch funktionelle Assays analysiert, um die fokale Adhäsionsdynamik zu bewerten und die Zelladhäsion an den gelierten Bioink durch Immunfluoreszenzassay zu untersuchen. Zellverhalten und Lebensfähigkeit werden in Zeitverlaufsexperimenten mit einem Lebendzell-Bildgebungssystem (Incucyte Live Cells Analysis Systems) gemessen.

Darüber hinaus werden 2 Aliquots von Knochengewebeproben, die von Patienten stammen, in flüssigem Stickstoff eingefroren (nachdem sie in ein kryoprotektives Medium mit Proteaseinhibitoren getaucht wurden). Aus diesen Proben werden Proteine ​​und Metaboliten mithilfe eines firmeninternen standardisierten Protokolls isoliert. Die extrahierten Proben werden dann mithilfe des FASP-Aufschlussprotokolls (Filter-Aided Sample Preparation) aufgeschlossen. Anschließend werden die Proben mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert. Auch Metaboliten werden mittels LC-MS/MS bewertet und mittels HPLC getrennt. Anschließend werden die erhaltenen Ergebnisse zu Proteinen und Metaboliten durch eine integrierte Signalweganalyse (unter Verwendung von IPA) analysiert, um ein multiomisches Profil jedes Patienten zu erstellen und so arzneimittelfähige Ziele zu identifizieren, die bei der Arzneimittelentwicklung genutzt werden können. Computergestützte Arzneimitteldesign-Tools, darunter molekulares Docking und virtuelles Screening, werden eingesetzt, um die Leitverbindungen aus Arzneimittel-/Chemikaliendatenbanken zu identifizieren, die mit den ausgewählten Zielen aus den integrierten Omic-Profil-Datensätzen interagieren können. Das dynamische Verhalten, die Stabilität und die Bindungswechselwirkungen von Ziel-Ligand-Komplexen werden durch Molekulardynamiksimulationen (MD) untersucht, um Bindungsmotive und Hotspots zu analysieren. MD-gestützte Erkenntnisse über molekulare Wechselwirkungen werden die Entwicklung und Optimierung neuer Verbindungen leiten. Dazu gehört die Einbeziehung struktureller Modifikationen mit ligandenbasierten Ansätzen und die Durchführung eines virtuellen Screenings zur Verbesserung der Bindungsaffinität, Selektivität und Arzneimittelähnlichkeit. Die durch diese In-silico-Studien identifizierten Biomoleküle werden dann kommerziell erworben und in PLGA-NPs eingekapselt. In diesem Zusammenhang werden Nanopräzipitation und Einzelemulsion für hydrophobe Nutzlasten genutzt, während für hydrophile Nutzlasten die Doppelemulsions-Lösungsmittelverdampfungstechnik (w1/o/w2) eingesetzt wird. Anschließend werden PLGA, die ausgewählte Verbindungen liefern, in eine Hydrogel-Matrix (GelMA) komplexiert. Die funktionellen trophischen und pro-regenerativen Eigenschaften der Bioink-Verbindung, die Biomoleküle liefert, werden in MSC bewertet, um osteogene Eigenschaften zu testen – durch ALP-Aktivitätstest, In-vitro-Mineralisierungsfärbung und Marker-Genexpressionsanalyse. Darüber hinaus werden menschliche Endothelzellen der Nabelschnurvene (kommerzielle Linie) mit dem GelMA-NPs-Wirkstoffkomplex behandelt, um die angiogenen Eigenschaften durch Zählen und Größenbestimmung der in vitro gebildeten kapillarähnlichen Strukturen zu bewerten (Röhrchenbildungsassay).

Darüber hinaus wird ein kleiner Aliquot peripheren venösen Blutes (2–3 ml bei pädiatrischen Patienten und bis zu 7 ml bei erwachsenen Patienten) aus routinemäßigen klinischen Untersuchungen entnommen. PBMCs werden mithilfe der Ficoll-Dichtegradientenzentrifugationstechnik aus Vollblutproben isoliert. Monozyten-/Makrophagenzellen werden dann durch CD14-Antikörper-konjugierte Magnetkügelchen getrennt und in vitro mit Faktoren (d. h. M-CSF, RANKL), um reife Osteoklasten zu bilden. Diese werden verwendet, um die Bioresorbierbarkeit der GelMA-NP-Verbindung zu bewerten. Kurz gesagt, Osteoklasten werden auf den nanostrukturierten GelMA-NP-Oberflächen ausgesät und die Expression typischer Osteoklasten-spezifischer Marker wird durch Immunfluoreszenzanalyse bewertet. SEM- und Immunfluoreszenztests werden verwendet, um die Osteoklasten-Bioink-Grenzfläche ultrastrukturell sichtbar zu machen und die Resorption zwei- und dreidimensional zu unterscheiden.

Von Patienten stammende MSC/Osteoprogenitoren und Osteoklasten werden ebenfalls genutzt, um 2D- und 3D-In-vitro-Kulturen zu erhalten, um die biologische Mikroumgebung an der Knochen-Implantat-Grenze nachzuahmen und den entwickelten Bioink-Komplex zu validieren. Die Bioink-Komponenten werden je nach den Zielen jedes Tests entweder mit Zellen biogedruckt (d. h. Zellen werden durch eine unabhängige Düse zugeführt), um zellbeladene Modelle zu bilden, oder auf die Wachstumsoberfläche von Zellkulturgefäßen gedruckt und vor der Zellaussaat gelieren gelassen. Die Freisetzungsdynamik von NP aus dem GelMA, die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen sowie die angiogenen und knochenregenerativen Effekte werden wie oben erwähnt bewertet.

Um seine antibakterielle Wirkung zu testen, werden sowohl das unbeladene GelMA als auch das GelMA-NP auf Petrischalen gedruckt und gelieren gelassen. Anschließend wird mit den opportunistischen Bakterienstämmen (E. coli, S. aureus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis und Pseudomonas aeruginosa) in der entsprechenden Kulturbrühe über Nacht. Die Adhäsion und Anzahl der Bakterien wird vergleichend bewertet und dosis- und zeitbezogene Auswirkungen getestet. Die antibakterielle Aktivität von GelMA-NP gegenüber GelMA wird auch durch REM-Bildgebung bestätigt.