NUPR1、MGMT、NDRG2、GLI1 遺伝子のメチル化パターンと GBM 患者の治療結果に対するそれらの影響

目標。 GBMおよびNNDサンプル中の4つの遺伝子のメチル化レベルを測定および比較することにより、GBMのエピジェネティックマーカーとしてのMGMT、NUPR1、NDRG2、およびGLI1遺伝子のメチル化レベルの潜在的な役割を解明する 研究者らは2020年9月から2022年10月まで参加者の募集を開始した、国立研究センターID#20110の医療倫理委員会およびエジプト、カイロのアインシャムス大学薬学部の研究倫理委員会から研究倫理委員会の研究倫理承認を受けた後、シリアル番号[ENREC-ASU 2020-8]。

インフォームドコンセントには、患者またはその一親等の親族が署名しました。 患者または対照のいずれかの研究参加者には、研究の問題点、目的、および目的が知らされました。 この研究は、2013 年に承認されたヘルシンキ宣言ガイドラインに従って実施されました。

合計58人の初発GBM治療歴のないエジプト人患者が、エジプト、カイロのアイン・シャムス大学病院医学部臨床腫瘍科から募集された。

患者の選択基準 GBM と最近診断され、Ester Clinical Oncology Group (ECOG) スケールでパフォーマンス レベルが 2 以下の成人患者 (18 歳以上)。

治療的アプローチ すべての GBM 患者は、完全な病歴、身体検査および神経学的検査を通じて臨床的に評価されました。 脳スキャンは、患者が標準化された治療プロトコルを受けられるようにするために行われました。これには、最大限の確実な外科的切除（可能な場合）と、それに続く従来の分割放射線療法（総線量60グレイ（Gy）、30回の分割で1回あたり2Gyを照射）が続きます。 6 週間）または低分割放射線療法（3 週間に 15 回に分けて 45 Gy）と、化学療法剤として TMZ を毎日体表面積 75 mg/m2 の用量で併用し、放射線療法が完了するまで定期的なフォローアップを行います。臨床的および放射線学的に再評価され、綿密な医学的監視のもと、1日目から5日目まで合計28日間、体表面積1平方メートルあたり150mgの用量で合計6サイクルのTMZ療法の補助療法が行われた。

標準的な医学的モニタリングを通じて、患者は放射線治療の45日後、その後は3か月ごと、または神経学的悪化の医学的証拠が現れるたびに、ガドリニウム増強磁気共鳴画像法（Gd-MRI）を使用した評価を受けました。

58 人の GBM 患者の人口統計的特徴が病院の医療記録から抽出されました。 これらには、年齢 [22-88] 、性別 (男性 35 名、女性 23 名)、ECOG スコアを含む臨床病理学的特徴、最初の GBM 手術日、腫瘍切除範囲、前述の治療アプローチ、生存転帰などの人口統計的属性が含まれます。無増悪生存期間（PFS）と全生存期間（OS）が含まれます。

NND グループは、無作為に採用された、性別が一致する 20 名の個人で構成されました。 年齢は4歳から54歳までで、男女比は10対10でした。 投薬を受けていないか、現在または過去に悪性腫瘍に苦しんでいない人。

方法、サンプル処理：腫瘍学的治療アプローチを利用する前に、脳標本は開腹定位生検技術を使用して外科的に回収され、その後中性緩衝ホルマリンに保存され、ヘマトキシリン・エオシン（HE）で染色されたパラフィンで包まれました。 その後、神経病理学者のパネルが登録されたすべてのサンプルを評価し、2016 CNS Tumors WHO 分類に従って診断を確認しました。

正確な DNA メチル化プロファイリングのための GBM 組織の品質の最適化 GBM 組織塊を選択するために次の包含基準が使用されました: 最低 80% の生存悪性細胞を含む GBM 組織の組織病理学的確認、およびアーカイブされたパラフィン包埋組織切片が容易に確認できる必要があります。利用可能。 その後の手順をすべての GBM 組織に対して実行しました。GBM 組織のホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) ブロックの完全なスライスを 4 ミクロンの厚さに切断し、その後標準的な HE 染色で染色して生存率を評価しました。提供された悪性組織の。 新たに切断した最大 10 μm 厚の FFPE スライスを使用して、PCR 分析用のサンプルを調製しました。

DNA 抽出 DNA は、QIAamp FFPE キット (Cat. No. 56404、カリフォルニア州バレンシア）、サプライヤーの指示に従ってください。 純度と濃度は、260 および 280 nm での吸収強度を測定することにより、ノンドロップ分光光度計 (Quawell、Q-500、Scribner、USA) によって測定し、1% アガロースゲルで検証しました。 単離された DNA サンプルは、MGMT、NUPR1、NDRG2、および GLI1 遺伝子のメチル化レベルを同定するためのその後の分析のために -20 ℃に保管されました。

メチル II 定量的 PCR による MGMT、NUPR1、NDRG2、および GLI1 メチル化パターンの検出 MGMT、NUPR1、NDRG2、および GLI1 のメチル化パターンは、EpiTect メチル II 定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) システムを使用して DNA 検索検体から検出されました (キアゲン、ドイツ）。 これは、メチル化特異的制限酵素を使用した断片化後に残る、抽出された DNA の量を検出することによって検証されます。 続いて、対象のプロモーター領域を含む標的遺伝子に特異的なメチル化プライマーを使用して、残りの DNA をリアルタイム PCR によって定量しました。

3.3.1. メチル化特異的制限酵素消化技術 この手順は、私たちの研究室で実装された特定の変更を加えて 2 段階で実行されました。 フェーズ I では、EpiTect メチル II DNA 制限キット (cat. いいえ。 335452 ) を反応に利用しました。 事前に抽出されていたゲノム DNA を 2 つの別々の PCR 反応チューブに 2 つの等価部分に等分しました。 1 つのチューブには制限酵素が添加されておらず、もう 1 つのチューブには非メチル化 DNA を選択的に消化するメチル化感受性の制限酵素が含まれています。 次に、チューブをサーマルサイクラー (SureCycle 8800、Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) 内で 37 °C で 6 時間インキュベートし、続いて 65 °C で 20 分間インキュベートしました。

3.3.2. 定量 PCR (qPCR) 分析 各チューブ内の残りのゲノム DNA サンプルの定量は、フェーズ II で Max3005P qPCR システム (Stratagene、Agilent Technologies、カリフォルニア州、米国) を使用して実行されました。 この段階を開始するために、各チューブからの残りの DNA の 5 μL アリコートを qPCR マスター ミックス (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix、Cat. いいえ。 330520）。 次いで、得られた混合物を、予め等分したMGMT、NUPR1、NDRG2、およびGLI1メチル化プライマーおよび非メチル化プライマーを含むPCRプレートに分注した。

統計分析 マン-ホイットニー U 検定を使用して、2 つのグループにわたる 4 つの遺伝子のメチル化レベルを比較しました。

4 つの遺伝子のプロモーター メチル化の最適なカットオフ ポイントは、各患者のメチル化の平均% を使用して (ROC) 曲線上にプロットした後に決定されました。 曲線下面積 (AUC) とテスト精度が計算されました。

生存データ（月単位）は、各化学療法ラインの開始から死亡日または最後の追跡調査まで計算されました。カプランマイヤー生存曲線を使用して PFS と OS の差が比較され、ログランク検定が使用されました。統計的有意性を判断します。

Cox 比例ハザード モデルは、多変量生存分析に使用されました。 Cox 回帰多変量分析は、OS に有意に関連する因子のエントリについては 0.05、除去については 0.1 の有意性を持つ順方向ステップワイズ パラメーターを使用して実行されました。

二値ロジスティック回帰モデルを使用して、4 つの遺伝子のメチル化の予後的重要性を分析しました。臨床転帰に関するMGMT、NUPR1、GLI1、およびNUPR1、性別、年齢、腫瘍サイズ、およびECOG。 ロジスティック回帰モデルの適合度は、Hosmer-Lemeshow 検定を使用して評価されました。

0.05未満のp値の有意水準が選択されました。 統計分析は、社会調査ソフトウェア統計パッケージ (SPSS) バージョン 27.0 (IBM、ニューヨーク州アーモンク) および R Core Team (2023) を使用して実行されました。