Modèles de méthylation des gènes NUPR1, MGMT, NDRG2 et GLI1 et leur impact sur les résultats thérapeutiques des patients atteints de GBM

Objectifs. Élucider le rôle potentiel des niveaux de méthylation des gènes MGMT, NUPR1, NDRG2 et GLI1 en tant que marqueurs épigénétiques du GBM en mesurant et en comparant les niveaux de méthylation de quatre gènes dans des échantillons de GBM et NND. Les chercheurs de l'étude ont commencé à recruter des participants de septembre 2020 à octobre 2022. , après avoir reçu les approbations éthiques de la recherche des comités d'éthique médicale du Centre national de recherche ID#20110 et du comité d'éthique de la recherche de la Faculté de pharmacie, Université Ain Shams, Le Caire, Égypte, numéro de série [ENREC-ASU 2020-8].

Les consentements éclairés ont été signés par les patients ou leurs proches au premier degré. Les participants à l'étude, qu'ils soient patients ou témoins, ont été informés du problème, du but et des objectifs de l'étude. L'étude a été menée conformément aux lignes directrices de la Déclaration d'Helsinki approuvées en 2013.

Au total, 58 patients égyptiens naïfs de traitement primaire pour le GBM ont été recrutés dans le département d'oncologie clinique de la faculté de médecine de l'hôpital universitaire Ain Shams, au Caire, en Égypte.

Critères d'inclusion des patients Patients adultes (âge > 18 ans) avec un diagnostic récent de GBM et ayant un niveau de performance inférieur ou égal à 2 sur l'échelle Ester Clinical Oncology Group (ECOG).

Approches thérapeutiques, tous les patients atteints de GBM ont été évalués cliniquement, à travers des antécédents médicaux complets, des examens physiques et neurologiques. Une scintigraphie cérébrale a été réalisée pour permettre au patient de recevoir un protocole thérapeutique standardisé, qui comprend l'ablation chirurgicale la plus sécurisée (si possible), suivie d'une radiothérapie fractionnée conventionnelle (dose globale de 60 gray (Gy), à raison de 2 Gy par fraction pendant 30 fractions pendant six semaines) ou radiothérapie hypofractionnée (45 Gy en 15 fractions pendant trois semaines) en association avec le TMZ comme agent chimiothérapeutique à la dose de 75 mg/m2 de surface corporelle par jour jusqu'à la fin de la radiothérapie avec suivi périodique, puis réévalué cliniquement et radiologiquement, avec un traitement adjuvant au total de six cycles de traitement par TMZ à la dose de 150 mg/m2 de surface corporelle du premier au cinquième jour pour un total de 28 jours sous surveillance médicale étroite.

Tout au long du suivi médical standard, les patients ont été évalués par imagerie par résonance magnétique améliorée au gadolinium (Gd-MRI) 45 jours après la radiothérapie, puis tous les trois mois ou chaque fois qu'une preuve médicale d'une détérioration neurologique est apparue.

Les caractéristiques démographiques de 58 patients atteints de GBM ont été extraites des dossiers médicaux de l'hôpital. Ceux-ci comprenaient des attributs démographiques tels que l'âge en années [22-88], le sexe (35 hommes et 23 femmes), les caractéristiques clinicopathologiques, y compris le score ECOG, la date de la chirurgie initiale du GBM, l'étendue de la résection tumorale, l'approche thérapeutique mentionnée précédemment et les résultats de survie. y compris la survie sans progression (SSP) et la survie globale (OS).

Le groupe NND comprenait 20 individus de même sexe recrutés au hasard. L'âge variait de 4 à 54 ans, avec un ratio hommes/femmes égal de 10 pour 10. Ceux qui ne recevaient aucun médicament ou qui souffraient d’une tumeur maligne actuelle ou passée.

Méthodes, traitement des échantillons : Avant d'utiliser toute approche thérapeutique oncologique, des échantillons de cerveau ont été prélevés chirurgicalement à l'aide d'une technique de biopsie stéréotaxique ouverte, puis conservés dans du formol tamponné neutre et enveloppés dans de la paraffine colorée à l'hématoxyline-éosine (HE). Un panel de neuropathologistes a ensuite évalué tous les échantillons recrutés pour confirmer le diagnostic conformément à la classification 2016 de l'OMS sur les tumeurs du SNC.

Optimisation de la qualité des tissus GBM pour un profilage précis de la méthylation de l'ADN. Les critères d'inclusion suivants ont été utilisés pour choisir les morceaux de tissus GBM : une confirmation histopathologique du tissu GBM avec un minimum de 80 % de cellules malignes viables, ainsi que des coupes de tissus archivées incluses en paraffine doivent être facilement disponible. Les procédures suivantes ont été effectuées sur tous les tissus GBM : des tranches complètes du bloc de tissus GBM fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) ont été coupées à une épaisseur de 4 microns, puis colorées avec les colorants HE standard pour évaluer la viabilité. du tissu malin donné. Des tranches FFPE nouvellement coupées, jusqu'à 10 µm d'épaisseur, ont été utilisées pour préparer des échantillons pour l'analyse PCR.

Extraction de l'ADN L'ADN a été isolé à partir d'échantillons FFPE via un kit QIAamp FFPE (Cat. No. 56404, Valencia, CA), selon les instructions du fournisseur. La pureté et la concentration ont été déterminées via un spectrophotomètre sans gouttes (Quawell, Q-500, Scribner, USA) en déterminant l'intensité de l'absorption à 260 et 280 nm et vérifiées sur un gel d'agarose à 1%. Les échantillons d'ADN isolés ont été conservés à -20 °C pour une analyse ultérieure afin d'identifier les niveaux de méthylation des gènes MGMT, NUPR1, NDRG2 et GLI1.

Détection des modèles de méthylation de MGMT, NUPR1, NDRG2 et GLI1 via la PCR quantitative Méthyl II Les modèles de méthylation de MGMT, NUPR1, NDRG2 et GLI1 ont été détectés dans des échantillons d'ADN récupérés à l'aide du système de réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) EpiTect Méthyl II ( Qiagen, Allemagne). Ceci est vérifié en détectant la quantité d’ADN extrait qui reste après la fragmentation à l’aide d’enzymes de restriction spécifiques à la méthylation. Par la suite, l’ADN restant a été quantifié par PCR en temps réel à l’aide d’amorces de méthylation spécifiques pour les gènes ciblés contenant des régions promotrices d’intérêt.

3.3.1. Technique de digestion enzymatique de restriction spécifique à la méthylation La procédure a été réalisée en deux phases avec certaines modifications mises en œuvre dans notre laboratoire. En phase I, le kit de restriction d’ADN EpiTect Méthyl II (cat. Non. 335452) a été utilisé pour les réactions. L'ADN génomique, qui avait été préalablement extrait, a été aliquoté en deux portions équivalentes dans 2 tubes de réaction PCR distincts ; un tube ne contenait aucune enzyme de restriction ajoutée et l'autre tube contenait une enzyme de restriction sensible à la méthylation qui digère sélectivement l'ADN non méthylé. Les tubes ont ensuite été soumis à une incubation dans un cycleur thermique (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, USA) à 37 °C pendant 6 heures, suivie d'une incubation à 65 °C pendant 20 minutes.

3.3.2. Analyse PCR quantitative (qPCR) La quantification des échantillons d'ADN génomique restants dans chaque tube a été réalisée au cours de la phase II à l'aide d'un système qPCR Max3005P (Stratagene, Agilent Technologies, CA, USA). Pour lancer cette phase, une aliquote de 5 µL de l’ADN restant de chaque tube a été mélangée au master mix qPCR (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Cat. Non. 330520 ). Le mélange résultant a ensuite été distribué dans une plaque PCR contenant des amorces méthylées et non méthylées pré-aliquotées MGMT, NUPR1, NDRG2 et GLI1.

Analyse statistique Le test Mann-Whitney U a été utilisé pour comparer les niveaux de méthylation des quatre gènes dans les deux groupes.

Les seuils optimaux pour la méthylation du promoteur des quatre gènes ont été déterminés après avoir été tracés sur des courbes (ROC) en utilisant le% moyen de méthylation chez chaque patient. L'aire sous la courbe (AUC) et la précision du test ont été calculées.

Les données de survie (en mois) ont été calculées depuis le début de chaque ligne de chimiothérapie jusqu'à la date du décès ou du dernier suivi. Les différences de SSP et de SG ont été comparées à l'aide des courbes de survie de Kaplan-Meier, et le test du log-rank a été utilisé pour déterminer la signification statistique.

Le modèle à risques proportionnels de Cox a été utilisé pour l'analyse de survie multivariée. Une analyse multivariée par régression de Cox a été réalisée à l'aide d'un paramètre pas à pas avancé avec une signification de 0,05 pour l'entrée et de 0,1 pour la suppression des facteurs significativement associés à la SG.

Le modèle de régression logistique binaire a été utilisé pour analyser la signification pronostique de la méthylation des quatre gènes ; MGMT, NUPR1, GLI1 et NUPR1, sexe, âge, taille de la tumeur et ECOG en ce qui concerne les résultats cliniques. La qualité de l'ajustement des modèles de régression logistique a été évaluée à l'aide du test de Hosmer-Lemeshow.

Un niveau de signification de valeur p inférieure à 0,05 a été choisi. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du progiciel statistique pour le logiciel d'études sociales (SPSS) version 27.0 (IBM, Armonk, NY) et de R Core Team (2023).