A NUPR1, MGMT, NDRG2 és GLI1 gének metilációs mintái és hatásuk a GBM-betegek terápiás kimenetelére

Célok. Az MGMT, NUPR1, NDRG2 és GLI1 gének metilációs szintjének a GBM epigenetikai markereként betöltött lehetséges szerepének tisztázása négy gén metilációs szintjének mérésével és összehasonlításával GBM és NND mintákban A tanulmány kutatói 2020 szeptemberétől 2022 októberéig kezdték meg a résztvevők toborzását. , miután megkapta a kutatásetikai jóváhagyást a National Research Center ID#20110 Orvosetikai Bizottságától és az Ain Shams Egyetem Gyógyszerészeti Karának Kutatási etikai Bizottságától, Kairó, Egyiptom, sorozatszám.[ENREC-ASU 2020-8].

A tájékozott beleegyezést a betegek vagy elsőfokú hozzátartozóik írták alá. A vizsgálatban résztvevő betegeket vagy a kontrollokat tájékoztatták a vizsgálat problémájáról, céljáról és célkitűzéseiről. A vizsgálatot a 2013-ban jóváhagyott Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően végezték.

Összesen 58 elsődleges GBM-kezelésben még nem részesült egyiptomi beteget vettek fel a kairói Ain Shams Egyetemi Kórház Klinikai Onkológiai Osztályáról, Orvostudományi Karáról.

Betegfelvételi kritériumok Felnőtt betegek (18 év felett), akiknél nemrégiben diagnosztizáltak GBM-et, és teljesítményük az Ester Clinical Oncology Group (ECOG) skálán 2 vagy annál kisebb volt.

Terápiás megközelítések: Minden GBM-beteget klinikailag értékeltek, teljes kórtörténet, fizikális és neurológiai vizsgálatok révén. Az agyvizsgálatot azért végezték, hogy a páciens standard terápiás protokollt kaphasson, amely magában foglalja a legnagyobb biztonságos műtéti eltávolítást (ha elérhető), majd a hagyományos frakcionált sugárkezelést (60 grey (Gy) aggregált dózis, frakciónként 2 Gy-t biztosítva 30 frakcióhoz hat hét) vagy hipo-frakcionált sugárterápia (45 Gy 15 frakcióban három hét alatt) egyidejű TMZ-vel, mint kemoterápiás szerrel napi 75 mg/testfelület m2 dózisban a sugárterápia befejezéséig időszakos követéssel, majd klinikailag és radiológiailag újraértékelve, adjuváns terápiát kapott összesen hat ciklus TMZ terápiában, 150 mg/testfelület m2 dózisban az elsőtől az ötödik napig, összesen 28 napig, szoros orvosi felügyelet mellett.

A szokásos orvosi monitorozás során a betegeket gadolínium-erősített mágneses rezonancia képalkotás (Gd-MRI) segítségével értékelték ki 45 nappal a sugárkezelést követően, majd ezt követően háromhavonta, vagy amikor a neurológiai állapot romlására utaló orvosi bizonyíték merült fel.

58 GBM-beteg demográfiai jellemzőit a kórház kórlapjaiból vették ki. Ezek közé tartoztak a demográfiai jellemzők, mint például az életkor években [22-88], a nem (35 férfi és 23 nő), klinikopatológiai jellemzők, beleértve az ECOG-pontszámot, a kezdeti GBM-műtét időpontja, a tumor reszekció mértéke, a korábban említett terápiás megközelítés, valamint a túlélési eredmények beleértve a progressziómentes túlélést (PFS) és a teljes túlélést (OS).

Az NND csoport 20 véletlenszerűen toborzott nemű egyénből állt. Az életkor 4 és 54 év között mozgott, a férfiak és nők aránya 10 és 10 között volt. Azok, akik nem kaptak semmilyen gyógyszert, vagy akik jelenlegi vagy korábbi rosszindulatú daganatban szenvedtek.

Módszerek, mintafeldolgozás: Bármilyen onkológiai terápiás megközelítés alkalmazása előtt az agymintákat nyílt sztereotaxiás biopsziás technikával sebészi úton kinyertük, majd semleges pufferolt formalinban megőriztük és hematoxilin-eozinnal (HE) festett paraffinba csomagoltuk. Ezt követően egy neuropatológusokból álló testület értékelte az összes bejegyzett mintát, hogy megerősítse a diagnózist a WHO 2016-os CNS Tumors osztályozása szerint.

A GBM-szövet minőségének optimalizálása a pontos DNS-metilációs profilalkotás érdekében A következő felvételi kritériumokat alkalmaztuk a GBM-szövetdarabok kiválasztásához: a GBM-szövet hisztopatológiai igazolása minimum 80%-ban életképes rosszindulatú sejtekkel, valamint az archivált paraffinba ágyazott szövetmetszet elérhető. A következő eljárásokat minden GBM szöveten elvégezték: A formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) GBM szövet blokk teljes szeletét 4 mikron vastagságban levágtuk, majd a standard HE festékekkel megfestettük az életképesség értékelésére. az adományozott rosszindulatú szövetből. Újonnan vágott, legfeljebb 10 um vastag FFPE szeleteket használtunk a minták előkészítésére a PCR elemzéshez.

DNS-kivonás A DNS-t FFPE-mintákból QIAamp FFPE kittel (Cat. No. 56404 , Valencia, CA), a szállító utasítása szerint. A tisztaságot és a koncentrációt cseppmentes spektrofotométerrel (Quawell, Q-500, Scribner, USA) határoztuk meg az abszorpció intenzitásának meghatározásával 260 és 280 nm-en, és 1%-os agarózgélen ellenőriztük. Az izolált DNS-mintákat -20 °C-on tartottuk az MGMT, NUPR1, NDRG2 és GLI1 gének metilációs szintjének azonosítására.

MGMT, NUPR1, NDRG2 és GLI1 metilációs mintázatok kimutatása Methyl II kvantitatív PCR-rel Az MGMT, NUPR1, NDRG2 és GLI1 metilezési mintázatait az EpiTect Methyl II kvantitatív polimeráz láncreakció (qP) segítségével detektáltuk DNS-mintákban. Qiagen, Németország). Ezt a fragmentáció után megmaradt extrahált DNS mennyiségének kimutatásával igazoljuk metilációspecifikus restrikciós enzimek segítségével. Ezt követően a fennmaradó DNS mennyiségét valós idejű PCR-rel határoztuk meg, specifikus metilációs primerek felhasználásával a megcélzott gének számára, amelyek a kérdéses promoter régiókat tartalmazzák.

3.3.1. Metilezés-specifikus restrikciós enzimes emésztési technika Az eljárást két fázisban végeztük, bizonyos, laboratóriumunkban végrehajtott módosításokkal. Az I. fázisban az EpiTect Methyl II DNS Restriction Kit (kat. nem. 335452) használtuk a reakciókhoz. Az előzőleg extrahált genomiális DNS-t két egyenértékű részre osztjuk 2 különálló PCR reakciócsőben; az egyik csőben nem volt hozzáadott restrikciós enzim, a másik csőben pedig metilációra érzékeny restrikciós enzim volt, amely szelektíven emészti a metilálatlan DNS-t. A csöveket ezután hőciklusos berendezésben (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, USA) 37 °C-on 6 órán át inkubáltuk, majd 65 °C-on 20 percig inkubáltuk.

3.3.2. Kvantitatív PCR (qPCR) elemzés Az egyes csövekben megmaradt genomiális DNS-minták mennyiségi meghatározását a II. fázisban Max3005P qPCR rendszerrel (Stratagene, Agilent Technologies, CA, USA) végeztük. Ennek a fázisnak az elindításához az egyes csövekből a maradék DNS-ből 5 μl-es alikvotot összekevertünk a qPCR master keverékkel (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Cat. nem. 330520 ). A kapott elegyet ezután egy PCR lemezre adagoljuk, amely előzetesen kiosztott MGMT, NUPR1, NDRG2 és GLI1 metilezett és metilált primereket tartalmazott.

Statisztikai elemzés A Mann-Whitney U tesztet a négy gén metilációs szintjének összehasonlítására használtuk a két csoportban.

A négy gén promóter-metilációjának optimális határpontjait a (ROC) görbékre való felrajzolás után határoztuk meg, az egyes betegek metilációjának átlagos százalékát használva. Kiszámoltuk a görbe alatti területet (AUC) és a teszt pontosságát.

A túlélési adatokat (hónapokban) az egyes kemoterápiás vonalak kezdetétől a halálozás időpontjáig vagy az utolsó utánkövetésig számítottuk. A PFS és az OS közötti különbségeket Kaplan-Meier túlélési görbék segítségével hasonlítottuk össze, és a log-rank tesztet használtuk. meghatározza a statisztikai szignifikanciát.

A többváltozós túlélési elemzéshez a Cox-féle arányos veszélyek modelljét használták. Cox regressziós többváltozós analízist végeztünk előre lépésenkénti paraméterrel, amelynek szignifikanciája 0,05 a belépéshez és 0,1 az operációs rendszerhez szignifikánsan összefüggő tényezők eltávolításához.

A bináris logisztikus regressziós modellt alkalmaztuk a négy gén metilációjának prognosztikai jelentőségének elemzésére; MGMT, NUPR1, GLI1 és NUPR1, nem, életkor, tumorméret és ECOG a klinikai eredmények tekintetében. A logisztikus regressziós modellek illeszkedési jóságát Hosmer-Lemeshow teszttel értékeltük.

0,05-nél kisebb p szignifikanciaszintet választottunk. A statisztikai elemzést a Statistical package for social studies szoftver (SPSS) 27.0-s verziója (IBM, Armonk, NY) és az R Core Team (2023) segítségével végeztük.