NUPR1-, MGMT-, NDRG2- ja GLI1-geenien metylaatiomallit ja niiden vaikutus GBM-potilaiden terapeuttisiin tuloksiin

Tavoitteet. Selvittää MGMT-, NUPR1-, NDRG2- ja GLI1-geenien metylaatiotasojen mahdollista roolia GBM:n epigeneettisinä markkereina mittaamalla ja vertaamalla neljän geenin metylaatiotasoja GBM- ja NND-näytteissä Tutkimuksen tutkijat aloittivat osallistujien rekrytoinnin syyskuusta 2020 lokakuuhun 2022. saatuaan tutkimuseettiset hyväksynnät National Research Center ID#20110:n lääketieteellisiltä eettisiltä komiteoilta ja Ain Shams Universityn farmasian tiedekunnan tutkimuseettiseltä komitealta, Kairo, Egypti, sarjanumero [ENREC-ASU 2020-8].

Tietoisen suostumuksen allekirjoittivat potilaat tai heidän ensimmäisen asteen sukulaiset. Tutkimuksen osallistujille joko potilaille tai verrokkeille kerrottiin tutkimuksen ongelmasta, tavoitteesta ja tavoitteista. Tutkimus toteutettiin vuonna 2013 hyväksytyn Helsinki-ohjeistuksen mukaisesti.

Yhteensä 58 ensisijaista GBM-hoitoa aiemmin saamatonta egyptiläistä potilasta rekrytoitiin Ain Shamsin yliopistollisen sairaalan lääketieteellisen tiedekunnan kliinisestä onkologiasta, Kairosta, Egyptistä.

Potilaiden osallistumiskriteerit Aikuiset potilaat (ikä > 18 vuotta), joilla on äskettäin diagnosoitu GBM ja joiden suorituskykytaso oli alle tai yhtä suuri kuin 2 Ester Clinical Oncology Group (ECOG) -asteikolla.

Terapeuttiset lähestymistavat, Kaikki GBM-potilaat arvioitiin kliinisesti täydellisen sairaushistorian, fyysisten ja neurologisten tutkimusten avulla. Aivoskannaus tehtiin, jotta potilas sai standardoidun terapeuttisen protokollan, joka sisältää suurimman varman kirurgisen poiston (jos mahdollista), jota seurasi tavanomainen fraktioitu sädehoito (kokonaisannos 60 gray (Gy), 2 Gy per fraktio 30 fraktiota kohden kuusi viikkoa) tai hypofraktioitu sädehoito (45 Gy 15 jakeessa kolmen viikon aikana) yhdessä samanaikaisen TMZ:n kanssa kemoterapeuttisena aineena annoksena 75 mg/m2 kehon pinta-alaa päivittäin, kunnes sädehoito on päättynyt säännöllisellä seurannalla, sitten arvioitiin uudelleen kliinisesti ja radiologisesti, annettiin adjuvanttihoitoa yhteensä kuudella TMZ-hoitojaksolla annoksella 150 mg/m2 kehon pinta-alaa päivästä 1–5 yhteensä 28 päivän ajan tiiviissä lääketieteellisessä valvonnassa.

Normaalin lääketieteellisen seurannan aikana potilaita arvioitiin gadoliinilla tehostetulla magneettikuvauksella (Gd-MRI) 45 päivää sädehoidon jälkeen ja sen jälkeen kolmen kuukauden välein tai aina, kun hermoston heikkenemisestä ilmeni lääketieteellisiä todisteita.

58 GBM-potilaan demografiset ominaisuudet poimittiin sairaalan lääketieteellisistä tiedoista. Näitä olivat demografiset ominaisuudet, kuten ikä vuosina [22-88], sukupuoli (35 miestä ja 23 naista), kliiniset patologiset ominaisuudet, mukaan lukien ECOG-pisteet, ensimmäisen GBM-leikkauksen päivämäärä, kasvaimen resektion laajuus ja aiemmin mainittu terapeuttinen lähestymistapa sekä eloonjäämistulokset mukaan lukien etenemisvapaa eloonjääminen (PFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS).

NND-ryhmään kuului 20 satunnaisesti valittua sukupuolta vastaavaa henkilöä. Ikä vaihteli 4–54-vuotiaiden välillä, ja miesten ja naisten välinen suhde oli 10–10. Ne, jotka eivät saaneet mitään lääkkeitä tai kärsivät mistään nykyisestä tai aiemmasta pahanlaatuisuudesta.

Menetelmät, näytteen käsittely: Ennen kuin käytettiin mitään onkologisia terapeuttisia lähestymistapoja, aivonäytteet otettiin kirurgisesti käyttämällä avointa stereotaktista biopsiatekniikkaa, säilytettiin sitten neutraalissa puskuroidussa formaliinissa ja käärittiin parafiiniin, joka oli värjätty hematoksyliini-eosiinilla (HE). Sen jälkeen neuropatologien paneeli arvioi kaikki ilmoittautuneet näytteet diagnoosin vahvistamiseksi WHO:n vuoden 2016 CNS Tumors -luokituksen mukaisesti.

GBM-kudoksen laadun optimointi tarkkaa DNA-metylaatioprofilointia varten GBM-kudospalojen valinnassa käytettiin seuraavia sisällyttämiskriteerejä: GBM-kudoksen histopatologinen vahvistus, jossa on vähintään 80 % eläviä pahanlaatuisia soluja, sekä arkistoidut parafiiniin upotetut kudosleikkeet on oltava helposti saatavilla. saatavilla. Seuraavat toimenpiteet suoritettiin kaikille GBM-kudoksille: Täysi viipale formaliinilla kiinnitetystä, parafiiniin upotetusta (FFPE) GBM-kudosblokista leikattiin 4 mikronin paksuiseksi ja värjättiin sen jälkeen tavanomaisilla HE-väreillä elinkelpoisuuden arvioimiseksi. luovutetusta pahanlaatuisesta kudoksesta. Äskettäin leikattuja, jopa 10 um:n paksuisia FFPE-viipaleita käytettiin näytteiden valmistukseen PCR-analyysiä varten.

DNA-uutto DNA eristettiin FFPE-näytteistä QIAamp FFPE -sarjan avulla (Cat. 56404 , Valencia, CA), toimittajan ohjeiden mukaan. Puhtaus ja konsentraatio määritettiin ei-pisara-spektrofotometrillä (Quawell, Q-500, Scribner, USA) määrittämällä absorption intensiteetti 260 ja 280 nm:ssä ja varmistettiin 1 % agaroosigeelillä. Eristetyt DNA-näytteet pidettiin -20 °C:ssa myöhempää analyysiä varten MGMT-, NUPR1-, NDRG2- ja GLI1-geenien metylaatiotasojen tunnistamiseksi.

MGMT-, NUPR1-, NDRG2- ja GLI1-metylaatiokuvioiden havaitseminen Methyl II:n kvantitatiivisella PCR:llä MGMT:n, NUPR1:n, NDRG2:n ja GLI1:n metylaatiokuviot on havaittu DNA-näytteistä käyttämällä kvantitatiivista EpiTect Methyl II -polymeraasiketjureaktiota (qP) Qiagen, Saksa). Tämä varmistetaan havaitsemalla uutetun DNA:n määrä, joka jää jäljelle fragmentoinnin jälkeen käyttämällä metylaatiospesifisiä restriktioentsyymejä. Sen jälkeen jäljellä oleva DNA kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR:llä käyttämällä spesifisiä metylaatioalukkeita kohdegeeneille, jotka sisältävät kiinnostavia promoottorialueita.

3.3.1. Metylaatiospesifinen restriktioentsyymihajotustekniikka Toimenpide suoritettiin kahdessa vaiheessa tietyin laboratoriossamme toteutetuin muokkauksin. Vaiheessa I EpiTect Methyl II DNA Restriction Kit (cat. ei. 335452) käytettiin reaktioihin. Genominen DNA, joka oli aiemmin uutettu, jaettiin kahteen ekvivalenttiin osaan 2 erillisessä PCR-reaktioputkessa; yhteen putkeen ei ollut lisätty restriktioentsyymiä ja toisessa putkessa oli metylaatioherkkä restriktioentsyymi, joka pilkkoo selektiivisesti metyloitumatonta DNA:ta. Sitten putkia inkuboitiin lämpösyklilaitteessa (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, USA) 37 °C:ssa 6 tunnin ajan, minkä jälkeen inkuboitiin 65 °C:ssa 20 minuuttia.

3.3.2. Kvantitatiivinen PCR (qPCR) -analyysi Jokaisessa putkessa jäljellä olevien genomi-DNA-näytteiden kvantifiointi suoritettiin vaiheessa II käyttämällä Max3005P qPCR-järjestelmää (Stratagene, Agilent Technologies, CA, USA). Tämän vaiheen aloittamiseksi sekoitettiin 5 μl:n alikvootti kustakin putkesta jäljellä olevaa DNA:ta qPCR-masteriseokseen (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Cat. ei. 330520). Tuloksena saatu seos annosteltiin sitten PCR-levylle, joka sisälsi esieriteltyjä MGMT-, NUPR1-, NDRG2- ja GLI1-metyloituja ja metyloimattomia alukkeita.

Tilastollinen analyysi Mann-Whitney U -testiä käytettiin vertaamaan neljän geenin metylaatiotasoja kahdessa ryhmässä.

Neljän geenin promoottorimetylaation optimaaliset raja-arvot määritettiin sen jälkeen, kun ne oli piirretty (ROC) käyriin käyttämällä kunkin potilaan metylaatioprosenttia. Käyrän alla oleva pinta-ala (AUC) ja testin tarkkuus laskettiin.

Eloonjäämistiedot (kuukausina) laskettiin kunkin kemoterapialinjan alusta kuolinpäivään tai viimeiseen seurantaan. PFS:n ja OS:n eroja verrattiin Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrillä, ja log-rank-testiä käytettiin määrittää tilastollinen merkitsevyys.

Monimuuttujaeloonjäämisanalyysissä käytettiin Coxin suhteellista riskimallia. Cox-regression monimuuttujaanalyysi suoritettiin käyttämällä eteenpäin suunnattua vaiheittaista parametria, jonka merkitsevyys oli 0,05 tulolle ja 0,1 merkitsevästi käyttöjärjestelmään liittyvien tekijöiden poistamiseksi.

Binääristä logistista regressiomallia käytettiin analysoimaan neljän geenin metylaation prognostista merkitystä; MGMT, NUPR1, GLI1 ja NUPR1, sukupuoli, ikä, kasvaimen koko ja ECOG suhteessa kliinisiin tuloksiin. Logististen regressiomallien sopivuutta arvioitiin Hosmer-Lemeshow-testillä.

Valittiin merkitsevyystaso, jonka p-arvo on pienempi kuin 0,05. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä Statistical Package for Social Studies -ohjelmiston (SPSS) versiota 27.0 (IBM, Armonk, NY) ja R Core Teamiä (2023).