Methylační vzorce genů NUPR1, MGMT, NDRG2 a GLI1 a jejich dopad na terapeutický výsledek pacientů s GBM

Cíle. Objasněte potenciální roli úrovní methylace genů MGMT, NUPR1, NDRG2 a GLI1 jako epigenetických markerů pro GBM měřením a porovnáním úrovní metylace čtyř genů ve vzorcích GBM a NND Výzkumníci studie zahájili nábor účastníků od září 2020 do října 2022 , poté, co obdržela etická schválení pro výzkum od Lékařských etických komisí Národního výzkumného centra ID#20110 a od Etické komise pro výzkum Farmaceutické fakulty Univerzity Ain Shams, Káhira, Egypt, sériové číslo.[ENREC-ASU 2020-8].

Informované souhlasy podepisovali pacienti nebo jejich příbuzní prvního stupně. Účastníci studie, buď pacienti, nebo kontroly, byli informováni o problému, cíle a cíle studie. Studie byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací schválenou v roce 2013.

Celkem 58 primárních egyptských pacientů dosud neléčených GBM bylo přijato z oddělení klinické onkologie Lékařské fakulty Ain Shams University Hospital, Káhira, Egypt.

Kritéria pro zařazení pacientů Dospělí pacienti (věk > 18 let) s nedávnou diagnózou GBM a měli výkonnostní úroveň nižší nebo rovnou 2 na stupnici Ester Clinical Oncology Group (ECOG).

Terapeutické přístupy, Všichni pacienti s GBM byli hodnoceni klinicky prostřednictvím úplné anamnézy, fyzikálních a neurologických vyšetření. Bylo provedeno skenování mozku, aby pacient mohl obdržet standardizovaný terapeutický protokol, který zahrnuje maximálně zabezpečené chirurgické odstranění (pokud je dosažitelné), následovanou konvenční frakcionovanou radioterapií (souhrnná dávka 60 šedých (Gy), za předpokladu 2 Gy na frakci pro 30 frakcí během šest týdnů) nebo hypofrakcionovanou radioterapií (45 Gy v 15 frakcích během tří týdnů) spolu se souběžným TMZ jako chemoterapeutikum v dávce 75 mg/m2 tělesného povrchu denně až do ukončení radiační terapie s periodickým sledováním, poté přehodnocena klinicky a radiologicky, podána adjuvantní terapií v celkem šesti cyklech terapie TMZ v dávce 150 mg/m2 tělesného povrchu od prvního do pátého dne po dobu celkem 28 dnů s pečlivým lékařským dohledem.

Během standardního lékařského sledování byli pacienti 45 dní po radioterapii a následně každé tři měsíce nebo kdykoli se objevily známky neurologického zhoršení podrobeni hodnocení pomocí zobrazování magnetickou rezonancí s gadoliniem (Gd-MRI).

Demografické charakteristiky 58 pacientů s GBM byly získány z lékařské dokumentace nemocnice. Ty zahrnovaly demografické atributy, jako je věk v letech [22–88], pohlaví (35 mužů a 23 žen), klinickopatologické charakteristiky včetně skóre ECOG, datum počáteční operace GBM, rozsah resekce nádoru a dříve zmíněný terapeutický přístup a výsledky přežití včetně přežití bez progrese (PFS) a celkového přežití (OS).

Skupina NND sestávala z 20 náhodně vybraných jedinců se shodným pohlavím. Věk se pohyboval od 4 do 54 let, se stejným poměrem mužů k ženám 10 až 10. Ti, kteří nedostávali žádné léky nebo trpěli nějakým současným nebo minulým zhoubným nádorem.

Metody, zpracování vzorků: Před použitím jakýchkoli onkologických terapeutických přístupů byly vzorky mozku chirurgicky odebrány pomocí techniky otevřené stereotaktické biopsie, poté konzervovány v neutrálním pufrovaném formalínu a zabaleny do parafínu obarveného hematoxylinem-eosinem (HE). Panel neuropatologů poté vyhodnotil všechny zapsané vzorky k potvrzení diagnózy v souladu s klasifikací WHO pro nádory CNS z roku 2016.

Optimalizace kvality tkáně GBM pro přesné profilování metylace DNA Pro výběr kousků tkáně GBM byla použita následující kritéria pro zařazení: histopatologické potvrzení tkáně GBM s minimálně 80 % životaschopných maligních buněk, stejně jako archivované tkáňové řezy zalité v parafínu musí být snadno dostupné. dostupný. Následné postupy byly provedeny na všech tkáních GBM: Úplný řez formalínem fixovaného, ​​v parafínu zalitého (FFPE) bloku tkání GBM byl nařezán v tloušťce 4 mikrony a následně obarven standardními HE barvivy, aby se vyhodnotila životaschopnost. darované maligní tkáně. Nově nařezané, až 10 um silné řezy FFPE byly použity k přípravě vzorků pro PCR analýzu.

Extrakce DNA DNA byla izolována ze vzorků FFPE pomocí soupravy QIAamp FFPE (kat. č. 56404, Valencia, CA), podle pokynů dodavatele. Čistota a koncentrace byly stanoveny pomocí bezkapkového spektrofotometru (Quawell, Q-500, Scribner, USA) stanovením intenzity absorpce při 260 a 280 nm a ověřeny na 1% agarózovém gelu. Izolované vzorky DNA byly udržovány při -20 °C pro následnou analýzu k identifikaci úrovní methylace genů MGMT, NUPR1, NDRG2 a GLI1.

Detekce methylačních vzorů MGMT, NUPR1, NDRG2 a GLI1 pomocí kvantitativní PCR Methyl II Methylační vzory MGMT, NUPR1, NDRG2 a GLI1 byly detekovány ve vzorcích získaných z DNA pomocí systému kvantitativní polymerázové řetězové reakce EpiTect Methyl II (qPCR) ( Qiagen, Německo). To je ověřeno detekcí množství extrahované DNA, které zbývá po fragmentaci pomocí methylačně specifických restrikčních enzymů. Následně byla zbývající DNA kvantifikována pomocí PCR v reálném čase za použití specifických methylačních primerů pro cílené geny, které obsahují promotorové oblasti zájmu.

3.3.1. Technika trávení restrikčních enzymů specifických pro methylaci Postup byl proveden ve dvou fázích s určitými úpravami implementovanými v naší laboratoři. Ve fázi I je souprava EpiTect Methyl II DNA Restriction Kit (kat. Ne. 335452) byl použit pro reakce. Genomová DNA, která byla předtím extrahována, byla rozdělena do dvou ekvivalentních částí ve 2 oddělených PCR reakčních zkumavkách; jedna zkumavka neměla žádný přidaný restrikční enzym a druhá zkumavka měla restrikční enzym citlivý na methylaci, který selektivně štěpí nemethylovanou DNA. Zkumavky byly poté podrobeny inkubaci v tepelném cyklovači (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, USA) při 37 °C po dobu 6 hodin, poté následovala inkubace při 65 °C po dobu 20 minut.

3.3.2. Kvantitativní analýza PCR (qPCR) Kvantitativní analýza zbývajících vzorků genomové DNA v každé zkumavce byla provedena ve fázi II pomocí systému Max3005P qPCR (Stratagene, Agilent Technologies, CA, USA). K zahájení této fáze bylo 5 μl alikvotu zbývající DNA z každé zkumavky smícháno s hlavní směsí qPCR (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Cat. Ne. 330520). Výsledná směs byla poté rozdělena na PCR destičku obsahující předem alikvotované MGMT, NUPR1, NDRG2 a GLI1 methylované a nemethylované primery.

Statistická analýza Mann-Whitney U test byl použit k porovnání úrovní methylace čtyř genů napříč dvěma skupinami.

Optimální hraniční body pro methylaci promotoru čtyř genů byly stanoveny po vynesení do (ROC) křivek s použitím průměrného % methylace u každého pacienta. Byla vypočtena plocha pod křivkou (AUC) a přesnost testu.

Údaje o přežití (v měsících) byly vypočteny od začátku každé linie chemoterapie do data úmrtí nebo posledního sledování. Rozdíly v PFS a OS byly porovnány pomocí Kaplan-Meierových křivek přežití a log-rank test byl použit k určit statistickou významnost.

Coxův model proporcionálních rizik byl použit pro vícerozměrnou analýzu přežití. Coxova regresní multivariační analýza byla provedena pomocí parametru dopředného krokového kroku s významností 0,05 pro vstup a 0,1 pro odstranění faktorů významně spojených s OS.

K analýze prognostického významu metylace čtyř genů byl použit binární logistický regresní model; MGMT, NUPR1, GLI1 a NUPR1, pohlaví, věk, velikost nádoru a ECOG s ohledem na klinické výsledky. Dobrá shoda logistických regresních modelů byla hodnocena pomocí Hosmer-Lemeshowova testu.

Byla zvolena hladina významnosti s hodnotou p menší než 0,05. Statistická analýza byla provedena pomocí Statistického balíčku pro software sociálních studií (SPSS) verze 27.0 (IBM, Armonk, NY) a R Core Team (2023).