Methylierungsmuster der Gene NUPR1, MGMT, NDRG2 und GLI1 und ihr Einfluss auf das Therapieergebnis von GBM-Patienten

Ziele. Klären Sie die mögliche Rolle der Methylierungsniveaus der MGMT-, NUPR1-, NDRG2- und GLI1-Gene als epigenetische Marker für GBM durch Messung und Vergleich der Methylierungsniveaus von vier Genen in GBM- und NND-Proben. Die Studienforscher begannen von September 2020 bis Oktober 2022 mit der Rekrutierung von Teilnehmern , nach Erhalt forschungsethischer Genehmigungen von den medizinischen Ethikkommissionen des Nationalen Forschungszentrums ID#20110 und von der Forschungsethikkommission der Fakultät für Pharmazie der Ain Shams-Universität, Kairo, Ägypten, Seriennummer [ENREC-ASU 2020-8].

Die Einverständniserklärung wurde von den Patienten oder ihren Verwandten ersten Grades unterzeichnet. Die Studienteilnehmer, entweder Patienten oder Kontrollpersonen, wurden über das Problem, das Ziel und die Zielsetzungen der Studie informiert. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den 2013 genehmigten Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

Insgesamt 58 primäre GBM-behandlungsnaive ägyptische Patienten wurden aus der Abteilung für klinische Onkologie der medizinischen Fakultät des Ain Shams University Hospital in Kairo, Ägypten, rekrutiert.

Einschlusskriterien für Patienten Erwachsene Patienten (Alter > 18 Jahre) mit einer kürzlich diagnostizierten GBM und einem Leistungsniveau von kleiner oder gleich 2 auf der Ester Clinical Oncology Group (ECOG)-Skala.

Therapeutische Ansätze: Alle GBM-Patienten wurden klinisch anhand einer vollständigen Anamnese sowie körperlicher und neurologischer Untersuchungen untersucht. Es wurde ein Gehirnscan durchgeführt, um dem Patienten ein standardisiertes Therapieprotokoll zu ermöglichen, das die größtmögliche sichere chirurgische Entfernung (falls möglich) umfasst, gefolgt von einer konventionellen fraktionierten Strahlentherapie (Gesamtdosis von 60 Gray (Gy), bereitgestellt 2 Gy pro Fraktion für 30 Fraktionen während der Behandlung sechs Wochen) oder hypofraktionierte Strahlentherapie (45 Gy in 15 Fraktionen über drei Wochen) bei gleichzeitiger Gabe von TMZ als Chemotherapeutikum in einer Dosis von 75 mg/m2 Körperoberfläche täglich bis zum Abschluss der Strahlentherapie mit anschließender regelmäßiger Nachuntersuchung klinisch und radiologisch neu bewertet, erhielt eine adjuvante Therapie mit insgesamt sechs Zyklen einer TMZ-Therapie in einer Dosierung von 150 mg/m2 Körperoberfläche vom ersten bis fünften Tag für insgesamt 28 Tage unter engmaschiger medizinischer Überwachung.

Während der üblichen medizinischen Überwachung wurden die Patienten 45 Tage nach der Strahlentherapie und anschließend alle drei Monate oder immer dann, wenn medizinische Beweise für eine neurologische Verschlechterung auftraten, einer Untersuchung mittels Gadolinium-verstärkter Magnetresonanztomographie (Gd-MRT) unterzogen.

Die demografischen Merkmale von 58 GBM-Patienten wurden aus den Krankenakten des Krankenhauses extrahiert. Dazu gehörten demografische Merkmale wie Alter in Jahren [22–88], Geschlecht (35 Männer und 23 Frauen), klinisch-pathologische Merkmale einschließlich ECOG-Score, Datum der ersten GBM-Operation, Ausmaß der Tumorresektion und zuvor erwähnter therapeutischer Ansatz sowie Überlebensergebnisse einschließlich progressionsfreiem Überleben (PFS) und Gesamtüberleben (OS).

Die NND-Gruppe bestand aus 20 nach dem Zufallsprinzip rekrutierten Personen gleichen Geschlechts. Das Alter reichte von 4 bis 54 Jahren, wobei das Verhältnis zwischen Männern und Frauen 10 zu 10 betrug. Diejenigen, die keine Medikamente erhielten oder an einer aktuellen oder früheren bösartigen Erkrankung litten.

Methoden, Probenverarbeitung: Vor der Anwendung onkologischer Therapieansätze wurden Gehirnproben chirurgisch mithilfe der offenen stereotaktischen Biopsietechnik entnommen, dann in neutral gepuffertem Formalin konserviert und in mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbtes Paraffin eingewickelt. Anschließend bewertete ein Gremium aus Neuropathologen alle aufgenommenen Proben, um die Diagnose gemäß der WHO-Klassifikation 2016 für ZNS-Tumoren zu bestätigen.

Optimierung der GBM-Gewebequalität für eine genaue DNA-Methylierungsprofilierung. Die folgenden Einschlusskriterien wurden zur Auswahl der GBM-Gewebestücke herangezogen: Eine histopathologische Bestätigung von GBM-Gewebe mit mindestens 80 % lebensfähigen malignen Zellen sowie archivierte, in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte müssen problemlos möglich sein verfügbar. Die nachfolgenden Verfahren wurden an allen GBM-Geweben durchgeführt: Eine vollständige Scheibe des formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) GBM-Gewebeblocks wurde in einer Dicke von 4 Mikrometern geschnitten und anschließend mit den Standard-HE-Färbungen angefärbt, um die Lebensfähigkeit zu bewerten des gespendeten bösartigen Gewebes. Zur Vorbereitung der Proben für die PCR-Analyse wurden frisch geschnittene, bis zu 10 µm dicke FFPE-Scheiben verwendet.

DNA-Extraktion DNA wurde aus FFPE-Proben mit einem QIAamp FFPE-Kit (Kat. Nr. 56404, Valencia, CA), wie vom Lieferanten angegeben. Reinheit und Konzentration wurden mit einem Non-Drop-Spektrophotometer (Quawell, Q-500, Scribner, USA) durch Bestimmung der Absorptionsintensität bei 260 und 280 nm bestimmt und auf einem 1 %igen Agarosegel verifiziert. Die isolierten DNA-Proben wurden zur anschließenden Analyse zur Identifizierung der Methylierungsgrade der MGMT-, NUPR1-, NDRG2- und GLI1-Gene bei -20 °C aufbewahrt.

Nachweis von MGMT-, NUPR1-, NDRG2- und GLI1-Methylierungsmustern mittels quantitativer Methyl-II-PCR. Methylierungsmuster von MGMT, NUPR1, NDRG2 und GLI1 wurden in DNA-gewonnenen Proben mithilfe des EpiTect Methyl II-Systems zur quantitativen Polymerasekettenreaktion (qPCR) nachgewiesen ( Qiagen, Deutschland). Dies wird durch den Nachweis der Menge an extrahierter DNA überprüft, die nach der Fragmentierung mit methylierungsspezifischen Restriktionsenzymen verbleibt. Anschließend wurde die verbleibende DNA durch Echtzeit-PCR unter Verwendung spezifischer Methylierungsprimer für die Zielgene quantifiziert, die interessierende Promotorregionen enthalten.

3.3.1. Methylierungsspezifische Restriktionsenzym-Verdauungstechnik Das Verfahren wurde in zwei Phasen durchgeführt, wobei bestimmte Modifikationen in unserem Labor vorgenommen wurden. In Phase I wird das EpiTect Methyl II DNA Restriction Kit (Kat. NEIN. 335452) wurde für die Reaktionen verwendet. Genomische DNA, die zuvor extrahiert worden war, wurde in zwei äquivalente Portionen in zwei separaten PCR-Reaktionsröhrchen aufgeteilt; Ein Röhrchen enthielt kein zugesetztes Restriktionsenzym und das andere Röhrchen enthielt ein methylierungsempfindliches Restriktionsenzym, das nicht methylierte DNA selektiv verdaut. Anschließend wurden die Röhrchen 6 Stunden lang bei 37 °C in einem Thermocycler (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, USA) inkubiert, gefolgt von einer 20-minütigen Inkubation bei 65 °C.

3.3.2. Quantitative PCR (qPCR)-Analyse Die Quantifizierung der verbleibenden genomischen DNA-Proben in jedem Röhrchen wurde in Phase II unter Verwendung eines Max3005P qPCR-Systems (Stratagene, Agilent Technologies, CA, USA) durchgeführt. Um diese Phase zu starten, wurden 5 μl Aliquot der verbleibenden DNA aus jedem Röhrchen mit dem qPCR-Mastermix (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Kat. NEIN. 330520 ). Die resultierende Mischung wurde dann in eine PCR-Platte verteilt, die vorab aliquotierte methylierte und nicht methylierte MGMT-, NUPR1-, NDRG2- und GLI1-Primer enthielt.

Statistische Analyse Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um die Methylierungsgrade der vier Gene in den beiden Gruppen zu vergleichen.

Die optimalen Grenzwerte für die Promotormethylierung der vier Gene wurden bestimmt, nachdem sie auf (ROC)-Kurven aufgetragen wurden, wobei der mittlere Prozentsatz der Methylierung bei jedem Patienten verwendet wurde. Die Fläche unter der Kurve (AUC) und die Testgenauigkeit wurden berechnet.

Die Überlebensdaten (in Monaten) wurden vom Beginn jeder Chemotherapielinie bis zum Todesdatum oder der letzten Nachuntersuchung berechnet. Unterschiede im PFS und OS wurden mithilfe von Kaplan-Meier-Überlebenskurven verglichen und der Log-Rank-Test wurde verwendet statistische Signifikanz bestimmen.

Für die multivariate Überlebensanalyse wurde das Cox-Proportional-Hazards-Modell verwendet. Die multivariate Cox-Regressionsanalyse wurde unter Verwendung eines schrittweisen Vorwärtsparameters mit einer Signifikanz von 0,05 für den Eintritt und 0,1 für die Entfernung von Faktoren durchgeführt, die signifikant mit dem OS assoziiert sind.

Das binäre logistische Regressionsmodell wurde verwendet, um die prognostische Bedeutung der Methylierung der vier Gene zu analysieren; MGMT, NUPR1, GLI1 und NUPR1, Geschlecht, Alter, Tumorgröße und ECOG im Hinblick auf klinische Ergebnisse. Die Anpassungsgüte der logistischen Regressionsmodelle wurde mithilfe des Hosmer-Lemeshow-Tests bewertet.

Als Signifikanzniveau wurde ein p-Wert von weniger als 0,05 gewählt. Die statistische Analyse wurde mit dem Statistical Package for Social Studies Software (SPSS), Version 27.0 (IBM, Armonk, NY) und R Core Team (2023) durchgeführt.