Padrões de metilação dos genes NUPR1, MGMT, NDRG2 e GLI1 e seu impacto no resultado terapêutico de pacientes com GBM

Objetivos. Elucidar o papel potencial dos níveis de metilação dos genes MGMT, NUPR1, NDRG2 e GLI1 como marcadores epigenéticos para GBM através da medição e comparação dos níveis de metilação de quatro genes em amostras de GBM e NND Os pesquisadores do estudo começaram a recrutar participantes de setembro de 2020 a outubro de 2022 , após receber aprovações éticas de pesquisa dos Comitês de Ética Médica do Centro Nacional de Pesquisa ID#20110 e do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Farmácia, Universidade Ain Shams, Cairo, Egito, número de série[ENREC-ASU 2020-8].

Os consentimentos informados foram assinados pelos pacientes ou seus familiares de primeiro grau. Os participantes do estudo, pacientes ou controles, foram informados sobre o problema, objetivo e objetivos do estudo. O estudo foi conduzido de acordo com as Diretrizes da Declaração de Helsinque aprovadas em 2013.

Um total de 58 pacientes egípcios sem tratamento primário com GBM foram recrutados no Departamento de Oncologia Clínica da Faculdade de Medicina do Hospital Universitário Ain Shams, Cairo, Egito.

Critérios de inclusão de pacientes Pacientes adultos (idade > 18 anos) com diagnóstico recente de GBM e com nível de desempenho menor ou igual a 2 na escala Ester Clinical Oncology Group (ECOG).

Abordagens terapêuticas, Todos os pacientes com GBM foram avaliados clinicamente, por meio de história médica completa, exames físicos e neurológicos. A tomografia cerebral foi realizada para permitir que o paciente recebesse protocolo terapêutico padronizado, que inclui a maior remoção cirúrgica segura (se possível), seguida de radioterapia fracionada convencional (dosagem agregada de 60 Gray (Gy), fornecida 2 Gy por fração para 30 frações durante seis semanas) ou radioterapia hipofracionada (45 Gy em 15 frações durante três semanas) juntamente com TMZ como agente quimioterápico na dose de 75 mg/m2 de área de superfície corporal diariamente até o término da radioterapia com acompanhamento periódico, então reavaliados clínica e radiologicamente, recebendo terapia adjuvante no total de seis ciclos de terapia com TMZ na dosagem de 150 mg/m2 de área de superfície corporal do primeiro ao quinto dia, por um total de 28 dias, com vigilância médica rigorosa.

Durante todo o monitoramento médico padrão, os pacientes foram submetidos à avaliação por ressonância magnética com gadolínio (Gd-MRI) 45 dias após a radioterapia e, posteriormente, a cada três meses ou sempre que surgisse prova médica de deterioração neurológica.

As características demográficas de 58 pacientes com GBM foram extraídas dos prontuários médicos do hospital. Estes incluíram atributos demográficos como idade em anos [22-88], sexo (35 homens e 23 mulheres), características clinicopatológicas incluindo pontuação ECOG, data da cirurgia inicial de GBM, extensão da ressecção do tumor e abordagem terapêutica mencionada anteriormente e resultados de sobrevivência incluindo sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global (OS).

O grupo NND foi composto por 20 indivíduos do mesmo sexo recrutados aleatoriamente. A idade variou de 4 a 54 anos, com proporção igual entre homens e mulheres de 10 para 10. Aqueles que não estavam recebendo nenhum medicamento ou sofriam de alguma doença maligna atual ou passada.

Métodos, processamento de amostras: Antes de utilizar qualquer abordagem terapêutica oncológica, as amostras cerebrais foram recuperadas cirurgicamente usando a técnica de biópsia estereotáxica aberta e depois preservadas em formalina tamponada neutra e envoltas em parafina corada com hematoxilina-eosina (HE). Um painel de neuropatologistas avaliou então todas as amostras inscritas para confirmar o diagnóstico de acordo com a classificação da OMS para tumores do SNC de 2016.

Otimizando a qualidade do tecido GBM para um perfil preciso de metilação do DNA Os seguintes critérios de inclusão foram usados ​​para escolher os pedaços de tecido GBM: uma confirmação histopatológica do tecido GBM com um mínimo de 80% de células malignas viáveis, bem como seções de tecido arquivadas embebidas em parafina devem ser prontamente disponível. Os procedimentos subsequentes foram realizados em todos os tecidos GBM: Fatia completa do bloco de tecidos GBM fixado em formalina e embebido em parafina (FFPE) foi cortada com uma espessura de 4 mícrons e subsequentemente corada com as colorações HE padrão para avaliar a viabilidade. do tecido maligno doado. Fatias de FFPE recém-cortadas com até 10 um de espessura foram usadas para preparar amostras para análise de PCR.

Extração de DNA O DNA foi isolado de amostras FFPE através de um kit QIAamp FFPE (Cat. Nº 56404, Valencia, CA), conforme orientação do fornecedor. A pureza e a concentração foram determinadas através de um espectrofotômetro sem gota (Quawell, Q-500, Scribner, EUA) através da determinação da intensidade de absorção a 260 e 280 nm e verificada em gel de agarose a 1%. As amostras de DNA isoladas foram mantidas a -20 0C para posterior análise para identificação dos níveis de metilação dos genes MGMT, NUPR1, NDRG2 e GLI1.

Detecção de padrões de metilação MGMT, NUPR1, NDRG2 e GLI1 via PCR quantitativo de Metil II Os padrões de metilação de MGMT, NUPR1, NDRG2 e GLI1 foram detectados em amostras recuperadas de DNA usando o sistema de reação em cadeia da polimerase quantitativa EpiTect Methyl II (qPCR) ( Qiagen, Alemanha). Isto é verificado detectando a quantidade de DNA extraído que permanece após a fragmentação usando enzimas de restrição específicas de metilação. Posteriormente, o DNA restante foi quantificado por PCR em tempo real utilizando primers de metilação específicos para os genes alvo que contêm regiões promotoras de interesse.

3.3.1. Técnica de digestão por enzima de restrição específica para metilação O procedimento foi conduzido em duas fases com certas modificações implementadas em nosso laboratório. Na Fase I, o Kit de Restrição de DNA EpiTect Methyl II (cat. não. 335452) foi utilizado para as reações. O DNA genômico, previamente extraído, foi dividido em duas porções equivalentes em 2 tubos de reação de PCR separados; um tubo não tinha enzima de restrição adicionada e o outro tubo tinha enzima de restrição sensível à metilação que digere seletivamente o DNA não metilado. Os tubos foram então submetidos à incubação em termociclador (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, EUA) a 37°C por 6 horas, seguido de incubação a 65°C por 20 minutos.

3.3.2. Análise quantitativa por PCR (qPCR) A quantificação das amostras restantes de DNA genômico em cada tubo foi realizada na Fase II usando um sistema qPCR Max3005P (Stratagene, Agilent Technologies, CA, EUA). Para iniciar esta fase, uma alíquota de 5 μL do DNA restante de cada tubo foi misturada com o master mix qPCR (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Cat. não. 330520). A mistura resultante foi então dispensada em uma placa de PCR contendo primers pré-aliquotados MGMT, NUPR1, NDRG2 e GLI1 metilados e não metilados.

Análise Estatística O teste U de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os níveis de metilação dos quatro genes nos dois grupos.

Os pontos de corte ideais para metilação do promotor dos quatro genes foram determinados após serem plotados em curvas (ROC) usando a% média de metilação em cada paciente. A área sob a curva (AUC) e a precisão do teste foram calculadas.

Os dados de sobrevivência (em meses) foram calculados desde o início de cada linha de quimioterapia até a data da morte ou do último acompanhamento. As diferenças na PFS e OS foram comparadas usando curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier, e o teste log-rank foi usado para determinar a significância estatística.

O modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para análise multivariada de sobrevivência. A análise multivariada de regressão de Cox foi realizada usando um parâmetro forward stepwise com significância de 0,05 para entrada e 0,1 para remoção de fatores significativamente associados à OS.

O modelo de regressão logística binária foi utilizado para analisar o significado prognóstico da metilação dos quatro genes; MGMT, NUPR1, GLI1 e NUPR1, sexo, idade, tamanho do tumor e ECOG em relação aos resultados clínicos. A qualidade do ajuste dos modelos de regressão logística foi avaliada pelo teste de Hosmer-Lemeshow.

Foi escolhido um nível de significância com valor de p menor que 0,05. A análise estatística foi realizada utilizando o software Statistical Package for Social Studies (SPSS) versão 27.0 (IBM, Armonk, NY) e R Core Team (2023).