Pattern di metilazione dei geni NUPR1, MGMT, NDRG2 e GLI1 e loro impatto sull'esito terapeutico dei pazienti affetti da GBM

Obiettivi. Chiarire il potenziale ruolo dei livelli di metilazione dei geni MGMT, NUPR1, NDRG2 e GLI1 come marcatori epigenetici per GBM attraverso la misurazione e il confronto dei livelli di metilazione di quattro geni nei campioni GBM e NND I ricercatori dello studio hanno iniziato a reclutare partecipanti da settembre 2020 a ottobre 2022 , dopo aver ricevuto l'approvazione etica della ricerca da parte dei Comitati Etici Medici del Centro Nazionale di Ricerca ID#20110 e del Comitato Etico della Ricerca della Facoltà di Farmacia, Università Ain Shams, Cairo, Egitto, numero di serie[ENREC-ASU 2020-8].

I consensi informati sono stati firmati dai pazienti o dai loro parenti di primo grado. I partecipanti allo studio, sia pazienti che controlli, sono stati informati del problema, dello scopo e degli obiettivi dello studio. Lo studio è stato condotto in conformità con le Linee Guida della Dichiarazione di Helsinki approvate nel 2013.

Un totale di 58 pazienti egiziani naïve al trattamento per GBM primario sono stati reclutati dal Dipartimento di Oncologia Clinica, Facoltà di Medicina, Ospedale universitario Ain Shams, Cairo, Egitto.

Criteri di inclusione dei pazienti Pazienti adulti (età > 18 anni) con una recente diagnosi di GBM e con un livello di prestazioni inferiore o uguale a 2 sulla scala Ester Clinical Oncology Group (ECOG).

Approcci terapeutici. Tutti i pazienti affetti da GBM sono stati valutati clinicamente, attraverso un'anamnesi medica completa ed esami fisici e neurologici. La scansione cerebrale è stata eseguita per consentire al paziente di ricevere un protocollo terapeutico standardizzato, che include la massima rimozione chirurgica sicura (se possibile), seguita da radioterapia frazionata convenzionale (dosaggio aggregato di 60 Gray (Gy), fornito 2 Gy per frazione per 30 frazioni durante sei settimane) o radioterapia ipofrazionata (45 Gy in 15 frazioni durante tre settimane) insieme a TMZ come agente chemioterapico in dose giornaliera di 75 mg/m2 di superficie corporea fino al completamento della radioterapia con follow-up periodico, quindi rivalutato clinicamente e radiologicamente, trattato con una terapia adiuvante per un totale di sei cicli di terapia TMZ alla dose di 150 mg/m2 di superficie corporea dal primo al quinto giorno per un totale di 28 giorni con stretta sorveglianza medica.

Durante il monitoraggio medico standard, i pazienti sono stati sottoposti a valutazione mediante risonanza magnetica con gadolinio (Gd-MRI) 45 giorni dopo la radioterapia e successivamente ogni tre mesi o ogni volta che emergeva prova medica di deterioramento neurologico.

Le caratteristiche demografiche di 58 pazienti GBM sono state estratte dalle cartelle cliniche dell'ospedale. Questi includevano attributi demografici come età in anni [22-88], sesso (35 maschi e 23 femmine), caratteristiche clinicopatologiche incluso il punteggio ECOG, data dell'intervento chirurgico iniziale per GBM, estensione della resezione del tumore e approccio terapeutico precedentemente menzionato ed esiti di sopravvivenza inclusa la sopravvivenza libera da progressione (PFS) e la sopravvivenza globale (OS).

Il gruppo NND comprendeva 20 individui dello stesso sesso reclutati in modo casuale. L'età variava dai 4 ai 54 anni, con un rapporto maschi-femmine pari da 10 a 10. Coloro che non stavano ricevendo alcun farmaco o che soffrivano di tumori maligni attuali o passati.

Metodi, elaborazione dei campioni: prima di utilizzare qualsiasi approccio terapeutico oncologico, i campioni cerebrali sono stati recuperati chirurgicamente utilizzando la tecnica di biopsia stereotassica aperta, quindi conservati in formalina tamponata neutra e avvolti in paraffina colorata con ematossilina-eosina (HE). Un gruppo di neuropatologi ha quindi valutato tutti i campioni arruolati per confermare la diagnosi in conformità con la classificazione OMS dei tumori del sistema nervoso centrale del 2016.

Ottimizzazione della qualità del tessuto GBM per un accurato profilo di metilazione del DNA Per scegliere i pezzi di tessuto GBM sono stati utilizzati i seguenti criteri di inclusione: una conferma istopatologica del tessuto GBM con un minimo dell'80% di cellule maligne vitali, nonché le sezioni di tessuto archiviate incluse in paraffina devono essere prontamente disponibile. Le procedure successive sono state eseguite su tutti i tessuti GBM: una fetta intera del blocco di tessuti GBM fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) è stata tagliata ad uno spessore di 4 micron e successivamente colorata con le colorazioni HE standard per valutare la vitalità del tessuto maligno donato. Per preparare i campioni per l'analisi PCR sono state utilizzate fette FFPE appena tagliate, spesse fino a 10 um.

Estrazione del DNA Il DNA è stato isolato dai campioni FFPE tramite un kit QIAamp FFPE (Cat. N. 56404, Valencia, CA), come indicato dal fornitore. La purezza e la concentrazione sono state determinate tramite uno spettrofotometro senza goccia (Quawell, Q-500, Scribner, USA) determinando l'intensità di assorbimento a 260 e 280 nm e verificate su un gel di agarosio all'1%. I campioni di DNA isolati sono stati conservati a -20°C per la successiva analisi per identificare i livelli di metilazione dei geni MGMT, NUPR1, NDRG2 e GLI1.

Rilevamento dei pattern di metilazione di MGMT, NUPR1, NDRG2 e GLI1 tramite PCR quantitativa Methyl II I pattern di metilazione di MGMT, NUPR1, NDRG2 e GLI1 sono stati rilevati in campioni recuperati dal DNA utilizzando il sistema di reazione a catena della polimerasi quantitativa EpiTect Methyl II (qPCR) ( Qiagen, Germania). Ciò viene verificato rilevando la quantità di DNA estratto che rimane dopo la frammentazione utilizzando enzimi di restrizione specifici per la metilazione. Successivamente, il DNA rimanente è stato quantificato mediante PCR in tempo reale utilizzando primer di metilazione specifici per i geni bersaglio che contengono regioni promotrici di interesse.

3.3.1. Tecnica di digestione enzimatica di restrizione specifica per la metilazione La procedura è stata condotta in due fasi con alcune modifiche implementate nel nostro laboratorio. Nella Fase I, il kit di restrizione del DNA EpiTect Methyl II (cat. NO. 335452) è stato utilizzato per le reazioni. Il DNA genomico, che era stato precedentemente estratto, è stato suddiviso in due porzioni equivalenti in 2 provette di reazione PCR separate; una provetta non aveva alcun enzima di restrizione aggiunto e l'altra provetta aveva un enzima di restrizione sensibile alla metilazione che digerisce selettivamente il DNA non metilato. Le provette sono state quindi sottoposte ad incubazione in un termociclatore (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, USA) a 37 °C per 6 ore, seguita da incubazione a 65 °C per 20 minuti.

3.3.2. Analisi PCR quantitativa (qPCR) La quantificazione dei restanti campioni di DNA genomico in ciascuna provetta è stata eseguita nella Fase II utilizzando un sistema qPCR Max3005P (Stratagene, Agilent Technologies, CA, USA). Per avviare questa fase, un'aliquota di 5 μL del DNA rimanente di ciascuna provetta è stata miscelata con la master mix qPCR (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Cat. NO. 330520). La miscela risultante è stata quindi dispensata in una piastra PCR contenente primer metilati e non metilati MGMT, NUPR1, NDRG2 e GLI1 pre-aliquotati.

Analisi statistica Il test U di Mann-Whitney è stato utilizzato per confrontare i livelli di metilazione dei quattro geni nei due gruppi.

I punti di cut-off ottimali per la metilazione del promotore dei quattro geni sono stati determinati dopo essere stati tracciati su curve (ROC) utilizzando la percentuale media di metilazione in ciascun paziente. Sono state calcolate l'area sotto la curva (AUC) e l'accuratezza del test.

I dati di sopravvivenza (in mesi) sono stati calcolati dall'inizio di ciascuna linea di chemioterapia fino alla data del decesso o dell'ultimo follow-up. Le differenze in PFS e OS sono state confrontate utilizzando le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier e il test dei ranghi logaritmici è stato utilizzato per determinare la significatività statistica.

Per l’analisi multivariata della sopravvivenza è stato utilizzato il modello dei rischi proporzionali di Cox. L'analisi multivariata della regressione di Cox è stata eseguita utilizzando un parametro graduale in avanti con una significatività di 0,05 per l'ingresso e 0,1 per la rimozione dei fattori significativamente associati all'OS.

Il modello di regressione logistica binaria è stato utilizzato per analizzare il significato prognostico della metilazione dei quattro geni; MGMT, NUPR1, GLI1 e NUPR1, sesso, età, dimensione del tumore ed ECOG rispetto agli esiti clinici. La bontà di adattamento dei modelli di regressione logistica è stata valutata utilizzando il test di Hosmer-Lemeshow.

È stato scelto un livello di significatività del valore p inferiore a 0,05. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il pacchetto statistico per il software di studi sociali (SPSS) versione 27.0 (IBM, Armonk, NY) e R Core Team (2023).