Wzorce metylacji genów NUPR1, MGMT, NDRG2 i GLI1 oraz ich wpływ na wyniki terapeutyczne pacjentów z GBM

Cele. Wyjaśnienie potencjalnej roli poziomów metylacji genów MGMT, NUPR1, NDRG2 i GLI1 jako markerów epigenetycznych GBM poprzez pomiar i porównanie poziomów metylacji czterech genów w próbkach GBM i NND. Naukowcy zajmujący się badaniem rozpoczęli rekrutację uczestników od września 2020 r. do października 2022 r. , po uzyskaniu zgód etycznych na prowadzenie badań od Komisji Etyki Lekarskiej Narodowego Centrum Badań ID#20110 oraz Komisji ds. Etyki Badań Wydziału Farmacji Uniwersytetu Ain Shams w Kairze, Egipt, nr seryjny [ENREC-ASU 2020-8].

Świadome zgody podpisali pacjenci lub ich krewni pierwszego stopnia. Uczestnicy badania, zarówno pacjenci, jak i grupa kontrolna, zostali poinformowani o problemie, celu i zadaniach badania. Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Wytycznych Helsińskich zatwierdzoną w 2013 roku.

W sumie 58 nieleczonych wcześniej egipskich pacjentów z pierwotnym GBM zrekrutowano z Oddziału Onkologii Klinicznej Wydziału Lekarskiego Szpitala Uniwersyteckiego Ain Shams w Kairze w Egipcie.

Kryteria włączenia pacjentów Dorośli pacjenci (wiek > 18 lat) z niedawną diagnozą GBM i poziomem sprawności mniejszym lub równym 2 w skali Ester Clinical Oncology Group (ECOG).

Podejścia terapeutyczne. Wszyscy pacjenci GBM byli oceniani klinicznie, na podstawie pełnego wywiadu, badań fizykalnych i neurologicznych. Wykonano skan mózgu, aby umożliwić pacjentowi otrzymanie standardowego protokołu terapeutycznego, który obejmuje możliwie największe bezpieczne usunięcie chirurgiczne (jeśli to możliwe), a następnie konwencjonalną radioterapię frakcjonowaną (dawka łączna 60 greyów (Gy), dostarczana w dawce 2 Gy na frakcję na 30 frakcji podczas sześć tygodni) lub radioterapię hipofrakcjonowaną (45 Gy w 15 frakcjach przez trzy tygodnie) wraz z jednoczesną TMZ jako środkiem chemioterapeutycznym w dawce 75 mg/m2 powierzchni ciała dziennie aż do zakończenia radioterapii z okresową kontrolą, następnie ponownie oceniony klinicznie i radiologicznie, po zastosowaniu terapii uzupełniającej w sumie przez sześć cykli terapii TMZ w dawce 150 mg/m2 powierzchni ciała od pierwszego do piątego dnia, łącznie przez 28 dni, pod ścisłym nadzorem medycznym.

W ramach standardowego monitorowania medycznego pacjentów poddawano ocenie za pomocą rezonansu magnetycznego wzmocnionego gadolinem (Gd-MRI) 45 dni po radioterapii, a następnie co trzy miesiące lub zawsze, gdy pojawiły się medyczne dowody potwierdzające pogorszenie stanu neurologicznego.

Z dokumentacji medycznej szpitala pobrano charakterystykę demograficzną 58 pacjentów GBM. Obejmowały one cechy demograficzne, takie jak wiek w latach [22–88], płeć (35 mężczyzn i 23 kobiety), cechy kliniczno-patologiczne, w tym wynik ECOG, data początkowej operacji GBM, zakres resekcji guza i wspomniane wcześniej podejście terapeutyczne oraz wyniki przeżycia włączając przeżycie wolne od progresji (PFS) i przeżycie całkowite (OS).

Grupa NND składała się z 20 osób dobranych pod względem płci, wybranych losowo. Wiek wahał się od 4 do 54 lat, przy takim samym stosunku mężczyzn do kobiet wynoszącym 10 do 10. Osoby, które nie otrzymywały żadnych leków lub cierpiały na obecny lub przeszły nowotwór złośliwy.

Metody, przetwarzanie próbek: Przed zastosowaniem jakichkolwiek onkologicznych metod terapeutycznych próbki mózgu pobrano chirurgicznie przy użyciu techniki otwartej biopsji stereotaktycznej, a następnie zakonserwowano w obojętnie buforowanej formalinie i zawinięto w parafinie barwionej hematoksyliną-eozyną (HE). Następnie panel neuropatologów ocenił wszystkie włączone próbki, aby potwierdzić diagnozę zgodnie z klasyfikacją WHO dotyczącą nowotworów CNS z 2016 r.

Optymalizacja jakości tkanki GBM w celu dokładnego profilowania metylacji DNA Do wyboru fragmentów tkanki GBM zastosowano następujące kryteria włączenia: histopatologiczne potwierdzenie tkanki GBM zawierającej co najmniej 80% żywych komórek złośliwych, a także zarchiwizowane skrawki tkanek zatopione w parafinie muszą być łatwo dostępne dostępny. Kolejne procedury przeprowadzono na wszystkich tkankach GBM: Pełny skrawek utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie (FFPE) bloku tkanek GBM pocięto na grubość 4 mikronów, a następnie wybarwiono standardowymi barwnikami HE w celu oceny żywotności oddanej tkanki złośliwej. Do przygotowania próbek do analizy PCR wykorzystano nowo pocięte skrawki FFPE o grubości do 10 µm.

Ekstrakcja DNA DNA wyizolowano z próbek FFPE za pomocą zestawu QIAamp FFPE (nr kat. nr 56404, Valencia, Kalifornia), zgodnie z zaleceniami dostawcy. Czystość i stężenie określono za pomocą spektrofotometru bez kropli (Quawell, Q-500, Scribner, USA) poprzez określenie intensywności absorpcji przy 260 i 280 nm i zweryfikowano na 1% żelu agarozowym. Wyizolowane próbki DNA trzymano w temperaturze -20°C do późniejszej analizy w celu określenia poziomów metylacji genów MGMT, NUPR1, NDRG2 i GLI1.

Wykrywanie wzorców metylacji MGMT, NUPR1, NDRG2 i GLI1 za pomocą ilościowej reakcji PCR metylu II Wzory metylacji MGMT, NUPR1, NDRG2 i GLI1 wykryto w próbkach pobranych DNA przy użyciu systemu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy EpiTect Methyl II (qPCR) ( Qiagen, Niemcy). Weryfikuje się to poprzez wykrywanie ilości wyekstrahowanego DNA pozostałego po fragmentacji przy użyciu enzymów restrykcyjnych specyficznych dla metylacji. Następnie pozostały DNA oznaczono ilościowo metodą PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu specyficznych starterów metylacyjnych dla docelowych genów, które zawierają interesujące regiony promotora.

3.3.1. Technika trawienia enzymami restrykcyjnymi specyficznymi dla metylacji. Procedurę przeprowadzono w dwóch fazach, z pewnymi modyfikacjami wdrożonymi w naszym laboratorium. W fazie I zestaw do restrykcji DNA EpiTect Methyl II (nr kat. NIE. 335452) wykorzystano w reakcjach. Genomowy DNA, który został wcześniej wyekstrahowany, podzielono na dwie równoważne części w 2 oddzielnych probówkach do reakcji PCR; jedna probówka nie zawierała enzymu restrykcyjnego wrażliwego na metylację, a druga probówka zawierała enzym restrykcyjny wrażliwy na metylację, który selektywnie trawi niemetylowany DNA. Probówki następnie poddano inkubacji w termocyklerze (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, Kalifornia, USA) w temperaturze 37°C przez 6 godzin, a następnie inkubowano w temperaturze 65°C przez 20 minut.

3.3.2. Ilościowa analiza PCR (qPCR) Ilościową ocenę pozostałych próbek genomowego DNA w każdej probówce przeprowadzono w fazie II przy użyciu systemu qPCR Max3005P (Stratagene, Agilent Technologies, Kalifornia, USA). Aby zainicjować tę fazę, 5 µl porcji pozostałego DNA z każdej probówki zmieszano z master mixem qPCR (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, nr kat. NIE. 330520 ). Powstałą mieszaninę następnie wylano na płytkę do PCR zawierającą wstępnie podzielone na porcje metylowane i niemetylowane startery MGMT, NUPR1, NDRG2 i GLI1.

Analiza statystyczna Do porównania poziomów metylacji czterech genów w obu grupach zastosowano test U Manna-Whitneya.

Optymalne punkty odcięcia dla metylacji promotora czterech genów określono po wykreśleniu na krzywych (ROC) przy użyciu średniego% metylacji u każdego pacjenta. Obliczono pole pod krzywą (AUC) i dokładność testu.

Dane dotyczące przeżycia (w miesiącach) obliczono od rozpoczęcia każdej linii chemioterapii do daty śmierci lub ostatniej wizyty kontrolnej. Różnice w PFS i OS porównano za pomocą krzywych przeżycia Kaplana-Meiera, a do obliczenia zastosowano test log-rank określić istotność statystyczną.

Do wieloczynnikowej analizy przeżycia wykorzystano model proporcjonalnych hazardów Coxa. Analizę wieloczynnikową regresji Coxa przeprowadzono przy użyciu parametru krokowego do przodu z istotnością 0,05 dla wprowadzenia i 0,1 dla usunięcia czynników istotnie związanych z OS.

Do analizy prognostycznego znaczenia metylacji czterech genów wykorzystano binarny model regresji logistycznej; MGMT, NUPR1, GLI1 i NUPR1, płeć, wiek, wielkość guza i ECOG w odniesieniu do wyników klinicznych. Dopasowanie modeli regresji logistycznej oceniano za pomocą testu Hosmera-Lemeshowa.

Wybrano poziom istotności p mniejszy niż 0,05. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu pakietu Statistical for Social Studies Software (SPSS) w wersji 27.0 (IBM, Armonk, NY) i R Core Team (2023).