Methyleringsmønstre af NUPR1-, MGMT-, NDRG2- og GLI1-generne og deres indvirkning på terapeutisk resultat af GBM-patienter

Mål. Belys den potentielle rolle af methyleringsniveauer af MGMT-, NUPR1-, NDRG2- og GLI1-generne som epigenetiske markører for GBM gennem måling og sammenligning af methyleringsniveauerne af fire gener i GBM- og NND-prøver. Undersøgelsesforskerne begyndte at rekruttere deltagere fra september 2020 til oktober 2022 , efter at have modtaget forskningsetiske godkendelser fra de medicinske etiske komiteer ved det nationale forskningscenter ID#20110 og fra den forskningsetiske komité på Det Farmaceutiske Fakultet, Ain Shams University, Cairo, Egypten, løbenr.[ENREC-ASU 2020-8].

Informerede samtykker blev underskrevet af patienter eller deres førstegradsslægtninge. Undersøgelsesdeltagere, enten patienter eller kontroller, blev informeret om undersøgelsens problem, mål og mål. Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationens retningslinjer godkendt i 2013.

I alt 58 primære GBM-behandlingsnaive egyptiske patienter blev rekrutteret fra den kliniske onkologiske afdeling, det medicinske fakultet, Ain Shams University Hospital, Cairo, Egypten.

Patienternes inklusionskriterier Voksne patienter (alder > 18 år) med en nylig diagnose af GBM og havde et præstationsniveau på mindre end eller lig med 2 på Ester Clinical Oncology Group (ECOG) skalaen.

Terapeutiske tilgange, Alle GBM-patienter blev evalueret klinisk gennem en komplet sygehistorie, fysiske og neurologiske undersøgelser. Hjernescanning blev udført for at gøre det muligt for patienten at modtage standardiseret terapeutisk protokol, som inkluderer den største sikrede kirurgiske fjernelse (hvis det er muligt), efterfulgt af konventionel fraktioneret strålebehandling (samlet dosis på 60 grå (Gy), givet 2 Gy pr. fraktion for 30 fraktioner under seks uger) eller hypofraktioneret strålebehandling (45 Gy i 15 fraktioner i løbet af tre uger) sammen med samtidig TMZ som kemoterapeutisk middel i dosis på 75 mg/m2 kropsoverflade dagligt indtil afslutningen af ​​strålebehandlingen med periodisk opfølgning, derefter reevalueret klinisk og radiologisk, givet en adjuverende terapi på i alt seks cyklusser af TMZ-terapi i en dosis på 150 mg/m2 kropsoverfladeareal fra dag et til fem i i alt 28 dage med nøje medicinsk overvågning.

Gennem standard medicinsk overvågning gennemgik patienterne evaluering ved hjælp af gadolinium-forstærket magnetisk resonansbilleddannelse (Gd-MRI) 45 dage efter strålebehandling og efterfølgende hver tredje måned, eller når der fremkom medicinske beviser for neurologisk forringelse.

De demografiske karakteristika for 58 GBM-patienter blev udtrukket fra hospitalets journaler. Disse inkluderede demografiske egenskaber såsom alder i år [22-88], køn (35 mænd og 23 kvinder), klinikopatologiske karakteristika, herunder ECOG-score, dato for første GBM-kirurgi, omfanget af tumorresektion og tidligere nævnte terapeutiske tilgang og overlevelsesresultater inklusive progressionsfri overlevelse (PFS) og samlet overlevelse (OS).

NND-gruppen omfattede 20 kønsmatchede individer rekrutteret tilfældigt. Alderen varierede fra 4 til 54 år med et ligeligt forhold mellem mænd og kvinder på 10 til 10. De, der ikke fik nogen medicin eller led af nogen nuværende eller tidligere malignitet.

Metoder, prøvebehandling: Før anvendelse af onkologiske terapeutiske tilgange, blev hjerneprøver udtaget kirurgisk ved hjælp af åben stereotaktisk biopsiteknik, derefter konserveret i neutral bufret formalin og pakket ind i paraffin farvet med hæmatoxylin-eosin (HE). Et panel af neuropatologer vurderede derefter alle tilmeldte prøver for at bekræfte diagnosen i overensstemmelse med 2016 CNS-tumorer WHO-klassifikationen.

Optimering af GBM-vævskvalitet til nøjagtig DNA-methyleringsprofilering Følgende inklusionskriterier blev brugt til at vælge GBM-vævsstykkerne: en histopatologisk bekræftelse af GBM-væv med minimum 80 % levedygtige maligne celler, samt arkiverede paraffinindlejrede vævssnit skal være let ledig. De efterfølgende procedurer blev udført på alle GBM-væv: Fuld skive af den formalin-fikserede, paraffin-indlejrede (FFPE) blok af GBM-væv blev skåret i en tykkelse på 4 mikron og efterfølgende farvet med standard HE-farvning for at evaluere levedygtigheden af det donerede maligne væv. Nyskåret, op til 10 um-tykke FFPE-skiver blev brugt til at forberede prøver til PCR-analyse.

DNA-ekstraktions-DNA blev isoleret fra FFPE-prøver via et QIAamp FFPE-kit (kat. nr. 56404, Valencia, CA), som anvist af leverandøren. Renhed og koncentration blev bestemt via et ikke-dråbe-spektrofotometer (Quawell, Q-500, Scribner, USA) ved at bestemme absorptionsintensiteten ved 260 og 280 nm og verificeret på en 1% agarosegel. De isolerede DNA-prøver blev holdt ved -20 °C til efterfølgende analyse for at identificere methyleringsniveauer af MGMT-, NUPR1-, NDRG2- og GLI1-gener.

Påvisning af MGMT, NUPR1, NDRG2 og GLI1 methyleringsmønstre via Methyl II kvantitativ PCR Methyleringsmønstre af MGMT, NUPR1, NDRG2 og GLI1 er blevet påvist i DNA-hentede prøver ved hjælp af EpiTect Methyl II kvantitativ polymerase kædereaktion (qPCR) Qiagen, Tyskland). Dette verificeres ved at detektere mængden af ​​ekstraheret DNA, der er tilbage efter fragmentering ved hjælp af methyleringsspecifikke restriktionsenzymer. Efterfølgende blev det resterende DNA kvantificeret ved real-time PCR under anvendelse af specifikke methyleringsprimere for de målrettede gener, der indeholder promotorregioner af interesse.

3.3.1. Methyleringsspecifik restriktion Enzymfordøjelsesteknik Proceduren blev udført i to faser med visse modifikationer implementeret i vores laboratorium. I fase I er EpiTect Methyl II DNA-restriktionssættet (kat. ingen. 335452) blev brugt til reaktionerne. Genomisk DNA, som tidligere var blevet ekstraheret, blev opdelt i to ækvivalente portioner i 2 separate PCR-reaktionsrør; det ene rør havde intet tilsat restriktionsenzym, og det andet rør havde methyleringsfølsomt restriktionsenzym, der selektivt fordøjer umethyleret DNA. Rørene blev derefter udsat for inkubation i en termisk cyklus (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, USA) ved 37 °C i 6 timer, efterfulgt af inkubation ved 65 °C i 20 minutter.

3.3.2. Kvantitativ PCR-analyse (qPCR) Kvantificeringen af ​​de resterende genomiske DNA-prøver i hvert rør blev udført i fase II under anvendelse af et Max3005P qPCR-system (Stratagene, Agilent Technologies, CA, USA). For at starte denne fase blev 5 μL aliquot af det resterende DNA fra hvert rør blandet med qPCR-masterblandingen (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, kat. ingen. 330520). Den resulterende blanding blev derefter dispenseret i en PCR-plade indeholdende præ-aliquoterede MGMT-, NUPR1-, NDRG2- og GLI1-methylerede og umethylerede primere.

Statistisk analyse Mann-Whitney U-testen blev brugt til at sammenligne methyleringsniveauerne af de fire gener på tværs af de to grupper.

De optimale afskæringspunkter for promotormethylering af de fire gener blev bestemt efter at være blevet plottet på (ROC) kurver under anvendelse af middelprocenten af ​​methylering i hver patient. Arealet under kurven (AUC) og testnøjagtigheden blev beregnet.

Overlevelsesdata (i måneder) blev beregnet fra starten af ​​hver kemoterapilinje til dødsdatoen eller sidste opfølgning. Forskelle i PFS og OS blev sammenlignet ved hjælp af Kaplan-Meier overlevelseskurver, og log-rank testen blev brugt til at bestemme statistisk signifikans.

Cox proportional hazards-modellen blev brugt til multivariat overlevelsesanalyse. Cox-regressions multivariat analyse blev udført ved hjælp af en fremadgående trinvis parameter med en signifikans på 0,05 for indtastning og 0,1 for fjernelse af faktorer, der signifikant er forbundet med OS.

Den binære logistiske regressionsmodel blev brugt til at analysere den prognostiske betydning af methyleringen af ​​de fire gener; MGMT, NUPR1, GLI1 og NUPR1, køn, alder, tumorstørrelse og ECOG med hensyn til kliniske resultater. Godheden af ​​de logistiske regressionsmodeller blev evalueret ved hjælp af Hosmer-Lemeshow-testen.

Et signifikansniveau på p-værdi mindre end 0,05 blev valgt. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Statistical Package for Social Studies software (SPSS) version 27.0 (IBM, Armonk, NY) og R Core Team (2023).