Patrones de metilación de los genes NUPR1, MGMT, NDRG2 y GLI1 y su impacto en el resultado terapéutico de los pacientes con GBM

Objetivos. Aclarar el papel potencial de los niveles de metilación de los genes MGMT, NUPR1, NDRG2 y GLI1 como marcadores epigenéticos para GBM mediante la medición y comparación de los niveles de metilación de cuatro genes en muestras de GBM y NND. Los investigadores del estudio comenzaron a reclutar participantes desde septiembre de 2020 hasta octubre de 2022. , después de recibir aprobaciones éticas en investigación de los Comités de Ética Médica del Centro Nacional de Investigación ID#20110 y del Comité de Ética en Investigación de la Facultad de Farmacia, Universidad Ain Shams, El Cairo, Egipto, número de serie [ENREC-ASU 2020-8].

Los consentimientos informados fueron firmados por los pacientes o sus familiares de primer grado. Los participantes del estudio, ya sean pacientes o controles, fueron informados sobre el problema, el objetivo y los objetivos del estudio. El estudio se realizó de acuerdo con las Directrices de la Declaración de Helsinki aprobadas en 2013.

Se reclutó a un total de 58 pacientes egipcios sin tratamiento previo con GBM del Departamento de Oncología Clínica de la Facultad de Medicina del Hospital Universitario Ain Shams, El Cairo, Egipto.

Criterios de inclusión de pacientes Pacientes adultos (edad > 18 años) con un diagnóstico reciente de GBM y que tenían un nivel de desempeño menor o igual a 2 en la escala Ester Clinical Oncology Group (ECOG).

Enfoques terapéuticos. Todos los pacientes con GBM fueron evaluados clínicamente, mediante un historial médico completo y exámenes físicos y neurológicos. Se realizó un escáner cerebral para permitir que el paciente recibiera un protocolo terapéutico estandarizado, que incluye la extirpación quirúrgica más segura (si es posible), seguida de radioterapia fraccionada convencional (dosis total de 60 grey (Gy), proporcionada 2 Gy por fracción para 30 fracciones durante seis semanas) o radioterapia hipofraccionada (45 Gy en 15 fracciones durante tres semanas) junto con TMZ concurrente como agente quimioterapéutico en dosis de 75 mg/m2 de superficie corporal diariamente hasta completar la radioterapia con seguimiento periódico, luego reevaluado clínica y radiológicamente, recibió una terapia adyuvante en un total de seis ciclos de terapia con TMZ en una dosis de 150 mg/m2 de superficie corporal desde el día uno al cinco durante un total de 28 días con estrecha vigilancia médica.

Durante el seguimiento médico estándar, los pacientes se sometieron a una evaluación mediante resonancia magnética potenciada con gadolinio (Gd-MRI) 45 días después de la radioterapia y posteriormente cada tres meses o cuando surgiera prueba médica de deterioro neurológico.

Las características demográficas de 58 pacientes con GBM se extrajeron de los registros médicos del hospital. Estos incluyeron atributos demográficos como edad en años [22-88], sexo (35 hombres y 23 mujeres), características clínico-patológicas, incluida la puntuación ECOG, fecha de la cirugía inicial de GBM, extensión de la resección del tumor y el enfoque terapéutico mencionado anteriormente, y resultados de supervivencia. incluida la supervivencia libre de progresión (SSP) y la supervivencia general (SG).

El grupo NND estaba compuesto por 20 individuos del mismo sexo reclutados al azar. La edad osciló entre 4 y 54 años, con una proporción igual entre hombres y mujeres de 10 a 10. Aquellos que no estuvieran recibiendo ningún medicamento o padeciendo alguna neoplasia maligna actual o pasada.

Métodos, procesamiento de muestras: antes de utilizar cualquier enfoque terapéutico oncológico, las muestras de cerebro se recuperaron quirúrgicamente mediante una técnica de biopsia estereotáxica abierta, luego se conservaron en formalina tamponada neutra y se envolvieron en parafina teñidas con hematoxilina-eosina (HE). Luego, un panel de neuropatólogos evaluó todas las muestras inscritas para confirmar el diagnóstico de acuerdo con la clasificación de la OMS de tumores del sistema nervioso central de 2016.

Optimización de la calidad del tejido GBM para un perfil preciso de metilación del ADN. Se utilizaron los siguientes criterios de inclusión para elegir los fragmentos de tejido GBM: una confirmación histopatológica de tejido GBM con un mínimo de 80% de células malignas viables, así como secciones de tejido incluidas en parafina archivadas deben ser fácilmente disponible. Los procedimientos posteriores se llevaron a cabo en todos los tejidos de GBM: se cortó un corte completo del bloque de tejidos de GBM fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE) con un espesor de 4 micrones y posteriormente se tiñó con las tinciones HE estándar para evaluar la viabilidad. del tejido maligno donado. Se utilizaron rodajas de FFPE recién cortadas de hasta 10 um de espesor para preparar muestras para el análisis por PCR.

Extracción de ADN El ADN se aisló de muestras FFPE mediante un kit QIAamp FFPE (Cat. No. 56404, Valencia, CA), según las indicaciones del proveedor. La pureza y la concentración se determinaron mediante un espectrofotómetro sin gota (Quawell, Q-500, Scribner, EE. UU.) determinando la intensidad de absorción a 260 y 280 nm y se verificaron en un gel de agarosa al 1%. Las muestras de ADN aisladas se mantuvieron a -20 0C para análisis posteriores para identificar los niveles de metilación de los genes MGMT, NUPR1, NDRG2 y GLI1.

Detección de patrones de metilación de MGMT, NUPR1, NDRG2 y GLI1 mediante PCR cuantitativa de metilo II Se han detectado patrones de metilación de MGMT, NUPR1, NDRG2 y GLI1 en muestras recuperadas de ADN utilizando el sistema de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) EpiTect Myl II ( Qiagen, Alemania). Esto se verifica detectando la cantidad de ADN extraído que queda después de la fragmentación utilizando enzimas de restricción específicas de metilación. Posteriormente, el ADN restante se cuantificó mediante PCR en tiempo real utilizando cebadores de metilación específicos para los genes diana que contienen regiones promotoras de interés.

3.3.1. Técnica de digestión con enzimas de restricción específicas de metilación El procedimiento se realizó en dos fases con ciertas modificaciones implementadas en nuestro laboratorio. En la Fase I, el kit de restricción de ADN EpiTect Myl II (cat. No. 335452 ) se utilizó para las reacciones. Se dividieron alícuotas del ADN genómico, que se había extraído previamente, en dos porciones equivalentes en 2 tubos de reacción de PCR separados; un tubo no tenía enzima de restricción agregada y el otro tubo tenía una enzima de restricción sensible a la metilación que digiere selectivamente el ADN no metilado. Luego, los tubos se sometieron a incubación en un ciclador térmico (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) a 37 °C durante 6 horas, seguido de una incubación a 65 °C durante 20 minutos.

3.3.2. Análisis cuantitativo por PCR (qPCR) La cuantificación de las muestras de ADN genómico restantes en cada tubo se realizó en la Fase II utilizando un sistema qPCR Max3005P (Stratagene, Agilent Technologies, CA, EE. UU.). Para iniciar esta fase, se mezcló una alícuota de 5 μl del ADN restante de cada tubo con la mezcla maestra de qPCR (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Cat. No. 330520). Luego, la mezcla resultante se dispensó en una placa de PCR que contenía cebadores metilados y no metilados de MGMT, NUPR1, NDRG2 y GLI1 en alícuotas previas.

Análisis estadístico La prueba U de Mann-Whitney se utilizó para comparar los niveles de metilación de los cuatro genes en los dos grupos.

Los puntos de corte óptimos para la metilación del promotor de los cuatro genes se determinaron después de representarlos en curvas (ROC) utilizando el% medio de metilación en cada paciente. Se calcularon el área bajo la curva (AUC) y la precisión de la prueba.

Los datos de supervivencia (en meses) se calcularon desde el inicio de cada línea de quimioterapia hasta la fecha de muerte o el último seguimiento. Las diferencias en la SSP y la SG se compararon mediante curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y se utilizó la prueba de rango logarítmico para determinar la significación estadística.

Se utilizó el modelo de riesgos proporcionales de Cox para el análisis de supervivencia multivariado. El análisis multivariado de regresión de Cox se realizó utilizando un parámetro paso a paso con una significación de 0,05 para la entrada y 0,1 para la eliminación de factores significativamente asociados con la SG.

Se utilizó el modelo de regresión logística binaria para analizar la importancia pronóstica de la metilación de los cuatro genes; MGMT, NUPR1, GLI1 y NUPR1, sexo, edad, tamaño del tumor y ECOG con respecto a los resultados clínicos. La bondad de ajuste de los modelos de regresión logística se evaluó mediante la prueba de Hosmer-Lemeshow.

Se eligió un nivel de significancia de valor de p inferior a 0,05. El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete estadístico para software de estudios sociales (SPSS) versión 27.0 (IBM, Armonk, NY) y R Core Team (2023).