Metyleringsmönster för generna NUPR1, MGMT, NDRG2 och GLI1 och deras inverkan på terapeutiskt resultat hos GBM-patienter

Mål. Belys den potentiella rollen av metyleringsnivåer av MGMT-, NUPR1-, NDRG2- och GLI1-gener som epigenetiska markörer för GBM genom att mäta och jämföra metyleringsnivåerna för fyra gener i GBM- och NND-prov. Studieforskarna började rekrytera deltagare från september 2020 till oktober 2022 , efter att ha erhållit forskningsetiska godkännanden från de medicinska etiska kommittéerna vid National Research Center ID#20110 och från den forskningsetiska kommittén för farmaceutiska fakulteten, Ain Shams University, Kairo, Egypten, serienummer [ENREC-ASU 2020-8].

Informerat samtycke undertecknades av patienter eller deras första gradens släktingar. Studiedeltagare, antingen patienter eller kontroller, informerades om studiens problem, syfte och mål. Studien genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationens riktlinjer som godkändes 2013.

Totalt 58 primära GBM-behandlingsnaiva egyptiska patienter rekryterades från den kliniska onkologiska avdelningen, medicinska fakulteten, Ain Shams University Hospital, Kairo, Egypten.

Patienternas inklusionskriterier Vuxna patienter (ålder > 18 år) med en nyligen diagnostiserad GBM och hade en prestationsnivå på mindre än eller lika med 2 på Ester Clinical Oncology Group (ECOG)-skalan.

Terapeutiska tillvägagångssätt, Alla GBM-patienter utvärderades kliniskt genom en fullständig medicinsk historia, fysiska och neurologiska undersökningar. Hjärnskanning gjordes för att patienten skulle få ett standardiserat terapeutiskt protokoll, vilket inkluderar det största säkra kirurgiska avlägsnandet (om möjligt), följt av konventionell fraktionerad strålbehandling (sammanlagd dos på 60 grått (Gy), förutsatt 2 Gy per fraktion för 30 fraktioner under sex veckor) eller hypofraktionerad strålbehandling (45 Gy i 15 fraktioner under tre veckor) tillsammans med samtidig TMZ som kemoterapeutiskt medel i en dos av 75 mg/m2 kroppsyta dagligen fram till avslutad strålbehandling med periodisk uppföljning, sedan omvärderad kliniskt och radiologiskt, gett en adjuvant terapi med totalt sex cykler av TMZ-terapi i en dos på 150 mg/m2 kroppsyta från dag ett till fem under totalt 28 dagar med noggrann medicinsk övervakning.

Under vanlig medicinsk övervakning genomgick patienterna en utvärdering med gadoliniumförstärkt magnetisk resonanstomografi (Gd-MRI) 45 dagar efter strålbehandling och därefter var tredje månad eller närhelst medicinska bevis på neurologisk försämring framkom.

De demografiska egenskaperna hos 58 GBM-patienter extraherades från sjukhusets journaler. Dessa inkluderade demografiska attribut som ålder i år [22-88], kön (35 män och 23 kvinnor), klinikopatologiska egenskaper inklusive ECOG-poäng, datum för initial GBM-operation, omfattning av tumörresektion och tidigare nämnda terapeutiska tillvägagångssätt och överlevnadsresultat inklusive progressionsfri överlevnad (PFS) och total överlevnad (OS).

NND-gruppen bestod av 20 könsmatchade individer rekryterade slumpmässigt. Åldern varierade från 4 till 54 år, med ett lika förhållande mellan män och kvinnor på 10 till 10. De som inte fick några mediciner eller lider av någon nuvarande eller tidigare malignitet.

Metoder, provbehandling: Innan några onkologiska terapeutiska tillvägagångssätt användes, togs hjärnprover kirurgiskt ut med hjälp av öppen stereotaktisk biopsiteknik och konserverades sedan i neutralt buffrat formalin och lindades in i paraffin färgat med hematoxylin-eosin (HE). En panel av neuropatologer bedömde sedan alla inskrivna prover för att bekräfta diagnosen i enlighet med 2016 års CNS-tumörer WHO-klassificeringen.

Optimering av GBM-vävnadskvalitet för exakt DNA-metyleringsprofilering Följande inklusionskriterier användes för att välja GBM-vävnadsbitarna: en histopatologisk bekräftelse av GBM-vävnad med minst 80 % viabla maligna celler, såväl som arkiverade paraffininbäddade vävnadssektioner måste göras lätt. tillgängliga. De efterföljande procedurerna utfördes på alla GBM-vävnader: Hela skivan av det formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) blocket av GBM-vävnader skars i en tjocklek av 4 mikron och färgades därefter med standard HE-färgerna för att utvärdera livsdugligheten av den donerade maligna vävnaden. Nyskurna, upp till 10 um-tjocka FFPE-skivor användes för att förbereda prover för PCR-analys.

DNA-extraktions-DNA isolerades från FFPE-prover via ett QIAamp FFPE-kit (kat. nr. 56404, Valencia, CA), enligt anvisningar från leverantören. Renhet och koncentration bestämdes via en droppfri spektrofotometer (Quawell, Q-500, Scribner, USA) genom bestämning av absorptionsintensiteten vid 260 och 280 nm och verifierades på en 1% agarosgel. De isolerade DNA-proverna hölls vid -20°C för efterföljande analys för att identifiera metyleringsnivåer av MGMT-, NUPR1-, NDRG2- och GLI1-gener.

Detektering av MGMT, NUPR1, NDRG2 och GLI1 metyleringsmönster via Methyl II kvantitativ PCR Metyleringsmönster av MGMT, NUPR1, NDRG2 och GLI1 har detekterats i DNA-hämtade prover med hjälp av EpiTect Methyl II kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) Qiagen, Tyskland). Detta verifieras genom att detektera mängden extraherat DNA som finns kvar efter fragmentering med användning av metyleringsspecifika restriktionsenzymer. Därefter kvantifierades det återstående DNA:t genom realtids-PCR med användning av specifika metyleringsprimrar för de riktade generna som innehåller promotorregioner av intresse.

3.3.1. Metyleringsspecifik restriktion Enzym Digestion teknik Förfarandet genomfördes i två faser med vissa modifieringar implementerade i vårt laboratorium. I fas I, EpiTect Methyl II DNA Restriction Kit (kat. Nej. 335452) användes för reaktionerna. Genomiskt DNA, som tidigare hade extraherats, delades upp i två ekvivalenta delar i två separata PCR-reaktionsrör; ett rör hade inget tillsatt restriktionsenzym och det andra röret hade metyleringskänsligt restriktionsenzym som selektivt smälter ometylerat DNA. Rören utsattes sedan för inkubation i en termisk cykler (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, USA) vid 37 °C under 6 timmar, följt av inkubation vid 65 °C under 20 minuter.

3.3.2. Kvantitativ PCR-analys (qPCR) Kvantifieringen av de återstående genomiska DNA-proverna i varje rör utfördes i fas II med användning av ett Max3005P qPCR-system (Stratagene, Agilent Technologies, CA, USA). För att initiera denna fas blandades 5 μL alikvot av återstående DNA från varje rör med qPCR-mastermixen (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Cat. Nej. 330520). Den resulterande blandningen dispenserades sedan i en PCR-platta innehållande föralikvoterade MGMT-, NUPR1-, NDRG2- och GLI1-metylerade och ometylerade primers.

Statistisk analys Mann-Whitney U-testet användes för att jämföra metyleringsnivåerna för de fyra generna över de två grupperna.

De optimala gränspunkterna för promotormetylering av de fyra generna bestämdes efter att ha plottats på (ROC)-kurvor med hjälp av medelprocenten av metylering i varje patient. Arean under kurvan (AUC) och testnoggrannheten beräknades.

Överlevnadsdata (i månader) beräknades från början av varje kemoterapilinje till dödsdatum eller sista uppföljning. Skillnader i PFS och OS jämfördes med Kaplan-Meier överlevnadskurvor, och log-rank testet användes för att bestämma statistisk signifikans.

Cox proportional hazards-modell användes för multivariat överlevnadsanalys. Cox-regressions multivariatanalys utfördes med hjälp av en framåt stegvis parameter med en signifikans på 0,05 för inträde och 0,1 för borttagande av faktorer signifikant associerade med OS.

Den binära logistiska regressionsmodellen användes för att analysera den prognostiska betydelsen av metyleringen av de fyra generna; MGMT, NUPR1, GLI1 och NUPR1, kön, ålder, tumörstorlek och ECOG med avseende på kliniska resultat. De logistiska regressionsmodellernas goda passform utvärderades med Hosmer-Lemeshow-testet.

En signifikansnivå för p-värde mindre än 0,05 valdes. Statistisk analys utfördes med hjälp av Statistical package for social studies software (SPSS) version 27.0 (IBM, Armonk, NY) och R Core Team (2023).