Metyleringsmønstre av NUPR1-, MGMT-, NDRG2- og GLI1-genene og deres innvirkning på terapeutisk resultat av GBM-pasienter

Mål. Belyse den potensielle rollen til metyleringsnivåene til MGMT-, NUPR1-, NDRG2- og GLI1-genene som epigenetiske markører for GBM gjennom å måle og sammenligne metyleringsnivåene til fire gener i GBM- og NND-prøver. Studieforskerne begynte å rekruttere deltakere fra september 2020 til oktober 2022 , etter å ha mottatt forskningsetiske godkjenninger fra de medisinske etiske komiteene ved National Research Center ID#20110 og fra den forskningsetiske komiteen ved Det farmasøytiske fakultet, Ain Shams University, Kairo, Egypt, serienummer [ENREC-ASU 2020-8].

Informerte samtykker ble signert av pasienter eller deres førstegradsslektninger. Studiedeltakere, enten pasienter eller kontroller, ble informert om studiens problem, mål og mål. Studien ble utført i samsvar med Helsinki-erklæringen godkjent i 2013.

Totalt 58 primære GBM-behandlingsnaive egyptiske pasienter ble rekruttert fra den kliniske onkologiske avdelingen, Det medisinske fakultet, Ain Shams universitetssykehus, Kairo, Egypt.

Pasientenes inklusjonskriterier Voksne pasienter (alder > 18 år) med en nylig diagnose av GBM og hadde et ytelsesnivå på mindre enn eller lik 2 på Ester Clinical Oncology Group (ECOG)-skalaen.

Terapeutiske tilnærminger, Alle GBM-pasienter ble evaluert klinisk, gjennom en fullstendig medisinsk historie, fysiske og nevrologiske undersøkelser. Hjerneskanning ble gjort for å gjøre det mulig for pasienten å motta standardisert terapeutisk protokoll, som inkluderer størst mulig sikret kirurgisk fjerning (hvis mulig), etterfulgt av konvensjonell fraksjonert strålebehandling (samlet dosering på 60 grå (Gy), gitt 2 Gy per fraksjon for 30 fraksjoner i løpet av seks uker) eller hypofraksjonert strålebehandling (45 Gy i 15 fraksjoner i løpet av tre uker) sammen med samtidig TMZ som kjemoterapeutisk middel i dose på 75 mg/m2 kroppsoverflate daglig inntil fullført strålebehandling med periodisk oppfølging, deretter reevaluert klinisk og radiologisk, gitt en adjuvant terapi på totalt seks sykluser med TMZ-behandling i en dosering på 150 mg/m2 kroppsoverflate fra dag én til fem i totalt 28 dager med nøye medisinsk overvåking.

Gjennom standard medisinsk overvåking gjennomgikk pasientene evaluering ved bruk av gadolinium-forsterket magnetisk resonansavbildning (Gd-MRI) 45 dager etter strålebehandling og deretter hver tredje måned eller når det dukket opp medisinske bevis på nevrologisk forverring.

De demografiske karakteristikkene til 58 GBM-pasienter ble hentet fra sykehusets medisinske journaler. Disse inkluderte demografiske attributter som alder i år [22-88], kjønn (35 menn og 23 kvinner), klinikopatologiske karakteristikker inkludert ECOG-score, dato for første GBM-operasjon, omfang av tumorreseksjon og tidligere nevnte terapeutiske tilnærminger og overlevelsesresultater inkludert progresjonsfri overlevelse (PFS) og total overlevelse (OS).

NND-gruppen besto av 20 kjønnsmatchede individer rekruttert tilfeldig. Alderen varierte fra 4 til 54 år, med et likt forhold mellom mann og kvinne på 10 til 10. De som ikke fikk noen medisiner eller led av noen nåværende eller tidligere malignitet.

Metoder, prøvebehandling: Før bruk av onkologiske terapeutiske tilnærminger, ble hjerneprøver hentet kirurgisk ved bruk av åpen stereotaktisk biopsiteknikk, deretter konservert i nøytral bufret formalin og pakket inn i parafin farget med hematoksylin-eosin (HE). Et panel av nevropatologer vurderte deretter alle påmeldte prøver for å bekrefte diagnosen i samsvar med 2016 CNS Tumors WHO-klassifisering.

Optimalisering av GBM-vevskvalitet for nøyaktig DNA-metyleringsprofilering Følgende inklusjonskriterier ble brukt for å velge GBM-vevsbitene: en histopatologisk bekreftelse av GBM-vev med minimum 80 % levedyktige maligne celler, samt arkiverte parafininnstøpte vevsseksjoner må være lett tilgjengelig tilgjengelig. De påfølgende prosedyrene ble utført på alle GBM-vev: Full skive av den formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) blokken av GBM-vev ble kuttet i en tykkelse på 4 mikron, og deretter farget med standard HE-fargene for å evaluere levedyktigheten av det donerte ondartede vevet. Nykuttede, opptil 10 um-tykke FFPE-skiver ble brukt til å forberede prøver for PCR-analyse.

DNA-ekstraksjons-DNA ble isolert fra FFPE-prøver via et QIAamp FFPE-sett (Kat. nr. 56404, Valencia, CA), som anvist av leverandøren. Renhet og konsentrasjon ble bestemt via et ikke-dråpespektrofotometer (Quawell, Q-500, Scribner, USA) ved å bestemme absorpsjonsintensiteten ved 260 og 280 nm og verifisert på en 1% agarosegel. De isolerte DNA-prøvene ble holdt ved -20 °C for påfølgende analyse for å identifisere metyleringsnivåer av MGMT-, NUPR1-, NDRG2- og GLI1-gener.

Deteksjon av MGMT-, NUPR1-, NDRG2- og GLI1-metyleringsmønstre via Methyl II kvantitativ PCR Metyleringsmønstre av MGMT, NUPR1, NDRG2 og GLI1 er påvist i DNA-hentede prøver ved bruk av EpiTect Methyl II kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) Qiagen, Tyskland). Dette verifiseres ved å påvise mengden ekstrahert DNA som gjenstår etter fragmentering ved bruk av metyleringsspesifikke restriksjonsenzymer. Deretter ble gjenværende DNA kvantifisert ved sanntids-PCR ved bruk av spesifikke metyleringsprimere for de målrettede genene som inneholder promoterregioner av interesse.

3.3.1. Metyleringsspesifikk restriksjon Enzymfordøyelsesteknikk Prosedyren ble utført i to faser med visse modifikasjoner implementert i vårt laboratorium. I fase I, EpiTect Methyl II DNA-restriksjonssett (kat. Nei. 335452 ) ble brukt for reaksjonene. Genomisk DNA, som tidligere hadde blitt ekstrahert, ble delt opp i to ekvivalente porsjoner i 2 separate PCR-reaksjonsrør; ett rør hadde ikke tilsatt restriksjonsenzym og det andre røret hadde metyleringssensitivt restriksjonsenzym som selektivt fordøyer umetylert DNA. Rørene ble deretter utsatt for inkubasjon i en termisk syklus (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, USA) ved 37 °C i 6 timer, etterfulgt av inkubering ved 65 °C i 20 minutter.

3.3.2. Kvantitativ PCR-analyse (qPCR) Kvantifiseringen av de gjenværende genomiske DNA-prøvene i hvert rør ble utført i fase II ved bruk av et Max3005P qPCR-system (Stratagene, Agilent Technologies, CA, USA). For å starte denne fasen ble 5 μL aliquot av gjenværende DNA fra hvert rør blandet med qPCR-masterblandingen (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, kat. Nei. 330520). Den resulterende blandingen ble deretter dispensert i en PCR-plate som inneholdt forhåndsalikvoterte MGMT-, NUPR1-, NDRG2- og GLI1-metylerte og umetylerte primere.

Statistisk analyse Mann-Whitney U-testen ble brukt til å sammenligne metyleringsnivåene til de fire genene på tvers av de to gruppene.

De optimale avskjæringspunktene for promotormetylering av de fire genene ble bestemt etter å ha blitt plottet på (ROC) kurver ved bruk av gjennomsnittlig % av metylering i hver pasient. Arealet under kurven (AUC) og testnøyaktigheten ble beregnet.

Overlevelsesdata (i måneder) ble beregnet fra starten av hver kjemoterapilinje til dødsdato eller siste oppfølging. Forskjeller i PFS og OS ble sammenlignet ved bruk av Kaplan-Meier overlevelseskurver, og log-rank test ble brukt for å bestemme statistisk signifikans.

Cox proporsjonale faremodell ble brukt for multivariat overlevelsesanalyse. Cox regresjon multivariat analyse ble utført ved å bruke en forover trinnvis parameter med en signifikans på 0,05 for inngang og 0,1 for fjerning av faktorer signifikant assosiert med OS.

Den binære logistiske regresjonsmodellen ble brukt til å analysere den prognostiske betydningen av metyleringen av de fire genene; MGMT, NUPR1, GLI1 og NUPR1, kjønn, alder, tumorstørrelse og ECOG med hensyn til kliniske utfall. Godheten til de logistiske regresjonsmodellene ble evaluert ved hjelp av Hosmer-Lemeshow-testen.

Et signifikansnivå på p-verdi mindre enn 0,05 ble valgt. Statistisk analyse ble utført ved bruk av Statistisk pakke for programvare for samfunnsstudier (SPSS) versjon 27.0 (IBM, Armonk, NY) og R Core Team (2023).