NUPR1、MGMT、NDRG2 和 GLI1 基因的甲基化模式及其对 GBM 患者治疗结果的影响

目标。 通过测量和比较 GBM 和 NND 样本中四个基因的甲基化水平，阐明 MGMT、NUPR1、NDRG2 和 GLI1 基因的甲基化水平作为 GBM 表观遗传标记的潜在作用该研究研究人员于 2020 年 9 月至 2022 年 10 月开始招募参与者，在获得国家研究中心医学伦理委员会 ID#20110 和埃及开罗艾因夏姆斯大学药学院研究伦理委员会的研究伦理批准后，序列号[ENREC-ASU 2020-8]。

知情同意书由患者或其一级亲属签署。 研究参与者（患者或对照）被告知研究问题、目的和目标。 该研究是根据 2013 年批准的《赫尔辛基指南宣言》进行的。

总共 58 名未接受过治疗的原发性 GBM 埃及患者是从埃及开罗艾因夏姆斯大学医院医学院临床肿瘤科招募的。

患者纳入标准近期诊断为 GBM 且 Ester 临床肿瘤组 (ECOG) 量表表现水平小于或等于 2 的成年患者（年龄 > 18 岁）。

治疗方法，通过完整的病史、体格和神经学检查，对所有 GBM 患者进行临床评估。 进行脑部扫描是为了使患者能够接受标准化的治疗方案，其中包括最安全的手术切除（如果可以实现），然后进行传统的分段放射治疗（总剂量为 60 戈瑞 (Gy)，在治疗期间每次分段提供 2 Gy，共 30 次）六周）或大分割放疗（三周期间 15 次 45 Gy）同时使用 TMZ 作为化疗药物，剂量为每天 75 mg/m2 体表面积，直至放疗完成并定期随访，然后重新进行临床和放射学评估，从第一天到第五天给予总共 6 个周期的 TMZ 治疗周期的辅助治疗，剂量为 150 mg/m2 体表面积，总共 28 天，并进行密切医学监测。

在整个标准医疗监测过程中，患者在放疗后 45 天接受钆增强磁共振成像 (Gd-MRI) 评估，随后每三个月或每当出现神经功能恶化的医学证据时接受评估。

从医院的病历中提取了 58 名 GBM 患者的人口特征。 其中包括人口统计属性，如年龄 [22-88]、性别（35 名男性和 23 名女性）、临床病理学特征（包括 ECOG 评分）、初次 GBM 手术日期、肿瘤切除范围、前面提到的治疗方法以及生存结果包括无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。

NND 组由随机招募的 20 名性别匹配的个体组成。 年龄在4岁至54岁之间，男女比例为10比10。 未接受任何药物治疗或当前或过去患有任何恶性肿瘤的人。

方法，样本处理：在采用任何肿瘤治疗方法之前，使用开放立体定向活检技术通过手术取出脑标本，然后保存在中性缓冲福尔马林中，并包裹在苏木精-伊红（HE）染色的石蜡中。 随后，神经病理学家小组根据 2016 年中枢神经系统肿瘤 WHO 分类对所有登记样本进行了评估，以确认诊断。

优化 GBM 组织质量以进行准确的 DNA 甲基化分析 以下纳入标准用于选择 GBM 组织块：GBM 组织的组织病理学确认至少含有 80% 的活恶性细胞，并且存档的石蜡包埋组织切片必须易于使用可用的。 对所有 GBM 组织进行后续程序：将福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE) 的 GBM 组织块切成 4 微米厚的完整切片，随后用标准 HE 染色剂染色以评估活力捐赠的恶性组织。 新切割的厚度达 10 微米的 FFPE 切片用于制备用于 PCR 分析的样品。

DNA 提取 通过 QIAamp FFPE 试剂盒（目录号：1000）从 FFPE 样品中分离出 DNA。 No. 56404 , Valencia, CA），按照供应商的指示。 通过无滴分光光度计（Quawell，Q-500，斯克里布纳，美国）通过测定 260 和 280 nm 处的吸收强度来确定纯度和浓度，并在 1% 琼脂糖凝胶上进行验证。 分离的DNA样品保存在-20 0C用于后续分析以确定MGMT、NUPR1、NDRG2和GLI1基因的甲基化水平。

通过 Mmethyl II 定量 PCR 检测 MGMT、NUPR1、NDRG2 和 GLI1 甲基化模式 使用 EpiTect Mmethyl II 定量聚合酶链反应 (qPCR) 系统在 DNA 回收样本中检测到 MGMT、NUPR1、NDRG2 和 GLI1 甲基化模式（德国凯杰）。 这可以通过检测使用甲基化特异性限制性酶进行片段化后剩余的提取 DNA 的量来验证。 随后，使用包含感兴趣的启动子区域的目标基因的特异性甲基化引物，通过实时 PCR 对剩余的 DNA 进行定量。

3.3.1. 甲基化特异性限制性酶消化技术 该程序分两个阶段进行，并在我们的实验室进行了某些修改。 在第一阶段，EpiTect Mmethyl II DNA Restriction Kit（货号： 不。 335452）用于反应。 将预先提取的基因组DNA等分到两个独立的PCR反应管中；一根管没有添加限制性酶，另一根管有甲基化敏感的限制性酶，可选择性消化未甲基化的 DNA。 然后将试管在热循环仪（SureCycler 8800，Agilent，Santa Clara，CA，USA）中于 37°C 下孵育 6 小时，然后在 65°C 下孵育 20 分钟。

3.3.2. 定量 PCR (qPCR) 分析 在第二阶段中，使用 Max3005P qPCR 系统（Stratagene，Agilent Technologies，CA，USA）对每个试管中剩余的基因组 DNA 样本进行定量。 为了启动此阶段，将每管中剩余 DNA 的 5 μL 等分试样与 qPCR 主混合物（RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix，目录号 11）混合。 不。 330520）。 然后将所得混合物分配到含有预先等分的 MGMT、NUPR1、NDRG2 和 GLI1 甲基化和未甲基化引物的 PCR 板中。

统计分析 Mann-Whitney U 检验用于比较两组中四个基因的甲基化水平。

使用每位患者甲基化的平均百分比绘制（ROC）曲线后，确定四个基因启动子甲基化的最佳截止点。 计算曲线下面积 (AUC) 和测试准确度。

生存数据（以月为单位）是从每个化疗线开始到死亡或最后一次随访的日期计算的。使用Kaplan-Meier生存曲线比较PFS和OS的差异，并使用对数秩检验来比较PFS和OS的差异。确定统计显着性。

Cox比例风险模型用于多变量生存分析。 使用前向逐步参数进行 Cox 回归多变量分析，输入显着性为 0.05，去除与 OS 显着相关的因素显着性为 0.1。

采用二元Logistic回归模型分析4个基因甲基化的预后意义； MGMT、NUPR1、GLI1 和 NUPR1、性别、年龄、肿瘤大小和 ECOG 与临床结果的关系。 使用 Hosmer-Lemeshow 检验评估逻辑回归模型的拟合优度。

选择 p 值小于 0.05 的显着性水平。 使用社会研究软件统计包 (SPSS) 27.0 版（IBM，Armonk，纽约）和 R Core Team (2023) 进行统计分析。