Паттерны метилирования генов NUPR1, MGMT, NDRG2 и GLI1 и их влияние на терапевтический результат пациентов с ГБМ

Цели. Выяснить потенциальную роль уровней метилирования генов MGMT, NUPR1, NDRG2 и GLI1 как эпигенетических маркеров GBM путем измерения и сравнения уровней метилирования четырех генов в образцах GBM и NND. Исследователи начали набор участников с сентября 2020 года по октябрь 2022 года. , после получения одобрения по этике исследований от комитетов по медицинской этике Национального исследовательского центра ID № 20110 и от комитета по этике исследований фармацевтического факультета Университета Айн-Шамс, Каир, Египет, серийный номер [ENREC-ASU 2020-8].

Информированное согласие подписывали пациенты или их родственники первой степени родства. Участники исследования (пациенты или контрольная группа) были проинформированы о проблеме, целях и задачах исследования. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией руководящих принципов, утвержденной в 2013 году.

В общей сложности 58 египетских пациентов, ранее не получавших первичного лечения ГБМ, были набраны из отделения клинической онкологии медицинского факультета университетской больницы Айн-Шамс, Каир, Египет.

Критерии включения пациентов Взрослые пациенты (возраст > 18 лет) с недавним диагнозом ГБМ и уровнем работоспособности менее или равным 2 по шкале Ester Clinical Oncology Group (ECOG).

Терапевтические подходы. Все пациенты с ГБМ были обследованы клинически, путем сбора анамнеза, физического и неврологического обследования. Сканирование головного мозга проводилось для того, чтобы пациент мог получить стандартизированный терапевтический протокол, который включает максимально безопасное хирургическое удаление (если это возможно) с последующей традиционной фракционированной лучевой терапией (совокупная доза 60 грей (Гр), при условии, что 2 Гр на фракцию в течение 30 фракций в течение шесть недель) или гипофракционированную лучевую терапию (45 Гр за 15 фракций в течение трех недель) одновременно с ТМЗ в качестве химиотерапевтического средства в дозе 75 мг/м2 площади поверхности тела ежедневно до завершения лучевой терапии с периодическим наблюдением, затем повторно оценен клинически и радиологически, учитывая адъювантную терапию в общей сложности в шести циклах терапии ТМЗ в дозе 150 мг/м2 площади поверхности тела с первого по пятый день в общей сложности 28 дней под тщательным медицинским наблюдением.

В ходе стандартного медицинского мониторинга пациенты проходили обследование с помощью магнитно-резонансной томографии с усилением гадолинием (Gd-MRI) через 45 дней после лучевой терапии, а затем каждые три месяца или всякий раз, когда появлялись медицинские доказательства неврологического ухудшения.

Демографические характеристики 58 пациентов с ГБМ были взяты из медицинских карт больницы. Они включали демографические характеристики, такие как возраст в годах [22-88], пол (35 мужчин и 23 женщины), клинико-патологические характеристики, включая оценку ECOG, дату первоначальной операции по ГБМ, степень резекции опухоли и ранее упомянутый терапевтический подход, а также результаты выживаемости. включая выживаемость без прогрессирования (ВБП) и общую выживаемость (ОВ).

Группа NND состояла из 20 человек идентичного пола, отобранных случайным образом. Возраст варьировался от 4 до 54 лет, при равном соотношении мужчин и женщин 10 к 10. Те, кто не получал никаких лекарств или страдал от каких-либо текущих или прошлых злокачественных опухолей.

Методы, обработка образцов. Перед применением каких-либо онкологических терапевтических подходов образцы головного мозга извлекали хирургическим путем с использованием метода открытой стереотаксической биопсии, затем консервировали в нейтральном забуференном формалине и завернули в парафин, окрашенный гематоксилин-эозином (HE). Затем группа невропатологов оценила все отобранные образцы для подтверждения диагноза в соответствии с классификацией ВОЗ по опухолям ЦНС 2016 года.

Оптимизация качества ткани GBM для точного определения профиля метилирования ДНК Для выбора фрагментов ткани GBM использовались следующие критерии включения: гистопатологическое подтверждение ткани GBM с минимум 80% жизнеспособных злокачественных клеток, а также архивированные срезы ткани, залитые в парафин, должны быть легко доступны. доступный. Последующие процедуры были проведены на всех тканях GBM: полный срез фиксированного формалином и залитого в парафин (FFPE) блока тканей GBM разрезали на толщину 4 микрона и впоследствии окрашивали стандартными красителями HE для оценки жизнеспособности. донорской злокачественной ткани. Недавно нарезанные срезы FFPE толщиной до 10 мкм использовали для подготовки образцов для ПЦР-анализа.

Экстракция ДНК ДНК выделяли из образцов FFPE с помощью набора QIAamp FFPE (кат. № 56404, Валенсия, Калифорния), согласно указанию поставщика. Чистоту и концентрацию определяли с помощью безкапельного спектрофотометра (Quawell, Q-500, Scribner, США) путем определения интенсивности поглощения при 260 и 280 нм и проверки на 1% агарозном геле. Выделенные образцы ДНК хранили при -20 0C для последующего анализа для определения уровней метилирования генов MGMT, NUPR1, NDRG2 и GLI1.

Обнаружение паттернов метилирования MGMT, NUPR1, NDRG2 и GLI1 с помощью количественной ПЦР с метилом II. Паттерны метилирования MGMT, NUPR1, NDRG2 и GLI1 были обнаружены в образцах ДНК, полученных с помощью системы количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) EpiTect Mmethyl II (qPCR) ( Кьяген, Германия). Это подтверждается путем определения количества экстрагированной ДНК, которая остается после фрагментации с использованием ферментов рестрикции, специфичных для метилирования. Впоследствии оставшуюся ДНК определяли количественно с помощью ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров метилирования для целевых генов, которые содержат интересующие области промотора.

3.3.1. Методика расщепления рестрикционным ферментом, специфичным для метилирования. Процедура проводилась в две фазы с некоторыми модификациями, реализованными в нашей лаборатории. На этапе I используется набор для ограничения ДНК EpiTect Mmethyl II (кат. нет. 335452) использовали для реакций. Геномную ДНК, которая была предварительно выделена, разделяли на две эквивалентные порции в 2 отдельных реакционных пробирках для ПЦР; в одной пробирке не было добавленного рестрикционного фермента, а в другой пробирке был чувствительный к метилированию рестрикционный фермент, который избирательно расщепляет неметилированную ДНК. Затем пробирки подвергали инкубации в термоциклере (SureCycler 8800, Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США) при 37 °C в течение 6 часов с последующей инкубацией при 65 °C в течение 20 минут.

3.3.2. Количественный анализ ПЦР (кПЦР) Количественный анализ оставшихся образцов геномной ДНК в каждой пробирке проводился на этапе II с использованием системы кПЦР Max3005P (Stratagene, Agilent Technologies, Калифорния, США). Чтобы инициировать эту фазу, аликвоту по 5 мкл оставшейся ДНК из каждой пробирки смешивали с мастер-миксом для кПЦР (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, кат. нет. 330520). Полученную смесь затем распределяли по планшетам для ПЦР, содержащим предварительно аликвоты метилированных и неметилированных праймеров MGMT, NUPR1, NDRG2 и GLI1.

Статистический анализ. Для сравнения уровней метилирования четырех генов в двух группах использовали U-тест Манна-Уитни.

Оптимальные точки отсечения для метилирования промотора четырех генов были определены после построения кривых (ROC) с использованием среднего процента метилирования у каждого пациента. Рассчитывали площадь под кривой (AUC) и точность теста.

Данные о выживаемости (в месяцах) рассчитывали от начала каждой линии химиотерапии до даты смерти или последнего наблюдения. Различия в ВБП и общей выживаемости сравнивали с использованием кривых выживаемости Каплана-Мейера, а для определения использовали лог-ранговый критерий. определить статистическую значимость.

Модель пропорциональных рисков Кокса использовалась для многомерного анализа выживаемости. Многомерный регрессионный анализ Кокса проводился с использованием прямого пошагового параметра со значимостью 0,05 для входа и 0,1 для удаления факторов, значимо связанных с ОС.

Модель бинарной логистической регрессии использовалась для анализа прогностической значимости метилирования четырех генов; MGMT, NUPR1, GLI1 и NUPR1, пол, возраст, размер опухоли и ECOG в отношении клинических исходов. Степень соответствия моделей логистической регрессии оценивалась с помощью теста Хосмера-Лемешоу.

Был выбран уровень значимости значения p менее 0,05. Статистический анализ проводился с использованием статистического пакета для программного обеспечения для социальных исследований (SPSS) версии 27.0 (IBM, Армонк, Нью-Йорк) и R Core Team (2023).