NUPR1, MGMT, NDRG2 및 GLI1 유전자의 메틸화 패턴과 이것이 GBM 환자의 치료 결과에 미치는 영향

목표. GBM 및 NND 샘플에서 4개 유전자의 메틸화 수준을 측정하고 비교함으로써 GBM에 대한 후성유전학적 마커로서 MGMT, NUPR1, NDRG2 및 GLI1 유전자의 메틸화 수준의 잠재적인 역할을 규명합니다. 연구 연구자들은 2020년 9월부터 2022년 10월까지 참가자 모집을 시작했습니다. , 국립 연구 센터 ID#20110의 의료 윤리 위원회와 이집트 카이로의 아인 샴스 대학교 약학부 연구 윤리 위원회로부터 연구 윤리 승인을 받은 후, 일련 번호[ENREC-ASU 2020-8].

환자 또는 1급 친척이 사전 동의에 서명했습니다. 연구 참가자들 중 환자 또는 대조군에게 연구 문제, 목표 및 목표에 대한 정보를 제공했습니다. 이 연구는 2013년에 승인된 헬싱키 지침 선언에 따라 수행되었습니다.

총 58명의 1차 GBM 치료 경험이 없는 이집트 환자가 이집트 카이로의 Ain Shams University Hospital 의과대학 임상 종양학과에서 모집되었습니다.

환자의 포함 기준 최근 GBM 진단을 받고 ECOG(에스테르 임상 종양학 그룹) 척도에서 수행 수준이 2 이하인 성인 환자(18세 이상).

치료적 접근법, 모든 GBM 환자는 전체 병력, 신체 및 신경학적 검사를 통해 임상적으로 평가되었습니다. 환자가 표준화된 치료 프로토콜을 받을 수 있도록 뇌 스캔을 실시했습니다. 이 프로토콜에는 최대의 보안된 수술적 제거(가능한 경우)와 기존의 분할 방사선 요법(총 선량 60회(Gy), 30분할 동안 분할당 2 Gy 제공)이 뒤따랐습니다. 6주) 또는 정기적인 추적관찰과 함께 방사선 치료가 완료될 때까지 매일 체표면적 75mg/m2의 용량으로 화학요법제로서 동시 TMZ와 함께 저분할 방사선요법(3주 동안 15분할로 45Gy), 이후 면밀한 의학적 감시를 통해 총 28일 동안 1일부터 5일까지 체표면적 150 mg/m2의 용량으로 총 6주기의 TMZ 치료에서 보조 요법을 제공하여 임상 및 방사선학적으로 재평가되었습니다.

표준 의료 모니터링 전반에 걸쳐 환자들은 방사선 치료 후 45일째, 이후 3개월마다 또는 신경학적 악화에 대한 의학적 증거가 나타날 때마다 가돌리늄 강화 자기공명영상(Gd-MRI)을 사용하여 평가를 받았습니다.

병원의 의무기록에서 GBM 환자 58명의 인구통계학적 특성을 추출하였다. 여기에는 연령[22-88세], 성별(남성 35명, 여성 23명), ECOG 점수를 포함한 임상병리학적 특성, 초기 GBM 수술 날짜, 종양 절제 범위, 이전에 언급한 치료 접근법 및 생존 결과와 같은 인구통계학적 특성이 포함되었습니다. 무진행 생존(PFS) 및 전체 생존(OS)을 포함합니다.

NND 그룹은 무작위로 모집된 20명의 성별이 일치하는 개인으로 구성되었습니다. 연령분포는 4세부터 54세까지였으며, 남녀비는 10대 10으로 동일했습니다. 약을 복용하고 있지 않거나 현재 또는 과거의 악성종양을 앓고 있는 자.

방법, 시료 처리: 종양학적 치료 접근법을 활용하기 전에 개방형 정위 생검 기술을 사용하여 뇌 표본을 외과적으로 회수한 다음 중성 완충 포르말린에 보존하고 헤마톡실린-에오신(HE)으로 염색된 파라핀으로 포장했습니다. 그런 다음 신경병리학자 패널은 등록된 모든 샘플을 평가하여 2016 CNS 종양 WHO 분류에 따른 진단을 확인했습니다.

정확한 DNA 메틸화 프로파일링을 위한 GBM 조직 품질 최적화 GBM 조직 덩어리를 선택하는 데 다음과 같은 포함 기준이 사용되었습니다. 최소 80%의 생존 악성 세포가 있는 GBM 조직과 보관된 파라핀 포매 조직 섹션에 대한 조직병리학적 확인이 쉽게 이루어져야 합니다. 사용 가능. 후속 절차는 모든 GBM 조직에 대해 수행되었습니다. GBM 조직의 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 블록의 전체 조각을 4 마이크론의 두께로 절단한 다음 표준 HE 염색으로 염색하여 생존성을 평가했습니다. 기증된 악성 조직의 모습입니다. 새로 절단된 최대 10um 두께의 FFPE 슬라이스를 사용하여 PCR 분석을 위한 샘플을 준비했습니다.

DNA 추출 DNA는 QIAamp FFPE 키트(Cat. 56404, Valencia, CA) 공급자의 지시에 따릅니다. 순도와 농도는 260 및 280 nm에서의 흡수 강도 측정을 통해 비노드롭 분광광도계(Quawell, Q-500, Scribner, USA)를 통해 측정하고 1% 아가로스 겔에서 검증했습니다. MGMT, NUPR1, NDRG2 및 GLI1 유전자의 메틸화 수준을 확인하기 위한 후속 분석을 위해 분리된 DNA 샘플을 -20℃에 보관했습니다.

메틸 II 정량적 PCR을 통한 MGMT, NUPR1, NDRG2 및 GLI1 메틸화 패턴 검출 MGMT, NUPR1, NDRG2 및 GLI1의 메틸화 패턴은 EpiTect Methyl II 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 시스템을 사용하여 DNA 검색 표본에서 검출되었습니다( 독일 퀴아겐). 이는 메틸화 특이적 제한효소를 이용하여 단편화 후 남아있는 추출된 DNA의 양을 검출함으로써 검증됩니다. 이어서, 관심 있는 프로모터 영역을 포함하는 표적 유전자에 대한 특정 메틸화 프라이머를 사용하여 실시간 PCR로 나머지 DNA를 정량화했습니다.

3.3.1. 메틸화 특정 제한 효소 소화 기술 이 절차는 실험실에서 구현된 특정 수정 사항을 포함하여 두 단계로 수행되었습니다. 1단계에서는 EpiTect Methyl II DNA Restriction Kit(cat. 아니요. 335452)를 반응에 활용하였다. 이전에 추출된 게놈 DNA를 2개의 별도 PCR 반응 튜브에 2개의 등가 부분으로 분취했습니다. 한 튜브에는 제한 효소가 첨가되지 않았고 다른 튜브에는 메틸화되지 않은 DNA를 선택적으로 소화하는 메틸화 민감성 제한 효소가 있었습니다. 그런 다음 튜브를 열 순환기(SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, USA)에서 37°C에서 6시간 동안 인큐베이션한 후 65°C에서 20분간 인큐베이션했습니다.

3.3.2. 정량적 PCR(qPCR) 분석 각 튜브에 남아 있는 게놈 DNA 샘플의 정량화는 Max3005P qPCR 시스템(Stratagene, Agilent Technologies, CA, USA)을 사용하여 2단계에서 수행되었습니다. 이 단계를 시작하기 위해 각 튜브에서 남은 DNA의 5 μL 분취량을 qPCR 마스터 믹스(RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Cat. 아니요. 330520). 그런 다음 생성된 혼합물을 미리 분취된 MGMT, NUPR1, NDRG2 및 GLI1 메틸화 및 비메틸화 프라이머가 포함된 PCR 플레이트에 분배했습니다.

통계 분석 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 두 그룹에 걸쳐 4개 유전자의 메틸화 수준을 비교했습니다.

4개 유전자의 프로모터 메틸화에 대한 최적의 차단점은 각 환자의 평균 메틸화%를 사용하여 (ROC) 곡선에 플롯팅된 후 결정되었습니다. 곡선 아래 면적(AUC)과 테스트 정확도가 계산되었습니다.

생존 데이터(개월 단위)는 각 화학 요법 시작일부터 사망일 또는 마지막 추적 관찰일까지 계산되었습니다. Kaplan-Meier 생존 곡선을 사용하여 PFS와 OS의 차이를 비교하고 로그 순위 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 결정합니다.

다변량 생존 분석에는 Cox 비례 위험 모델이 사용되었습니다. Cox 회귀 다변량 분석은 진입에 대해 0.05, OS와 유의미하게 연관된 요인 제거에 대해 0.1의 유의성을 갖는 전진 단계적 매개변수를 사용하여 수행되었습니다.

이진 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 4개 유전자의 메틸화의 예후적 중요성을 분석했습니다. 임상 결과와 관련하여 MGMT, NUPR1, GLI1 및 NUPR1, 성별, 연령, 종양 크기 및 ECOG. 로지스틱 회귀 모델의 적합도는 Hosmer-Lemeshow 테스트를 사용하여 평가되었습니다.

0.05 미만의 p 값의 유의 수준이 선택되었습니다. 통계 분석은 SPSS(Statistical package for social Studies 소프트웨어) 버전 27.0(IBM, Armonk, NY) 및 R Core Team(2023)을 사용하여 수행되었습니다.