Methyleringspatronen van de NUPR1-, MGMT-, NDRG2- en GLI1-genen en hun impact op de therapeutische uitkomst van GBM-patiënten

Doelstellingen. De potentiële rol van methylatieniveaus van de MGMT-, NUPR1-, NDRG2- en GLI1-genen als epigenetische markers voor GBM ophelderen door de methylatieniveaus van vier genen in GBM- en NND-monsters te meten en te vergelijken. De onderzoekers van het onderzoek begonnen van september 2020 tot oktober 2022 met het rekruteren van deelnemers , na ontvangst van ethische goedkeuringen voor onderzoek van de medisch-ethische commissies van het National Research Center ID#20110 en van de Research Ethics Committee van de Faculteit der Farmacie, Ain Shams University, Caïro, Egypte, serienummer [ENREC-ASU 2020-8].

Geïnformeerde toestemmingen werden ondertekend door patiënten of hun eerstegraads familieleden. Deelnemers aan de studie, zowel patiënten als controlepersonen, werden geïnformeerd over het onderzoeksprobleem, het doel en de doelstellingen. Het onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de Declaration of Helsinki Guidelines die in 2013 werd goedgekeurd.

In totaal werden 58 primaire GBM-behandelingsnaïeve Egyptische patiënten gerekruteerd bij de afdeling Klinische Oncologie, Faculteit der Geneeskunde, Ain Shams Universitair Ziekenhuis, Caïro, Egypte.

Inclusiecriteria voor patiënten Volwassen patiënten (leeftijd > 18 jaar) met een recente diagnose van GBM en een prestatieniveau van minder dan of gelijk aan 2 op de Ester Clinical Oncology Group (ECOG)-schaal.

Therapeutische benaderingen Alle GBM-patiënten werden klinisch geëvalueerd, via een volledige medische geschiedenis, fysieke en neurologische onderzoeken. Er werd een hersenscan uitgevoerd om de patiënt in staat te stellen een gestandaardiseerd therapeutisch protocol te ontvangen, dat de grootst mogelijke veilige chirurgische verwijdering omvat (indien haalbaar), gevolgd door conventionele gefractioneerde radiotherapie (totale dosering van 60 grijs (Gy), wat 2 Gy per fractie opleverde voor 30 fracties tijdens de behandeling. zes weken) of hypogefractioneerde radiotherapie (45 Gy in 15 fracties gedurende drie weken) naast gelijktijdig TMZ als chemotherapeutisch middel in een dosis van 75 mg/m2 lichaamsoppervlak per dag tot de voltooiing van de radiotherapie met periodieke follow-up, daarna klinisch en radiologisch opnieuw geëvalueerd, waarbij een adjuvante therapie werd gegeven met in totaal zes TMZ-therapiecycli in een dosering van 150 mg/m2 lichaamsoppervlak, van dag één tot vijf gedurende een totaal van 28 dagen, onder nauwlettend medisch toezicht.

Tijdens de standaard medische monitoring ondergingen patiënten een evaluatie met behulp van gadolinium-verbeterde magnetische resonantiebeeldvorming (Gd-MRI) 45 dagen na de radiotherapie en vervolgens elke drie maanden of telkens wanneer medisch bewijs van neurologische achteruitgang naar voren kwam.

De demografische kenmerken van 58 GBM-patiënten werden ontleend aan de medische dossiers van het ziekenhuis. Deze omvatten demografische kenmerken zoals leeftijd in jaren [22-88], geslacht (35 mannen en 23 vrouwen), klinisch-pathologische kenmerken, waaronder ECOG-score, datum van de eerste GBM-operatie, omvang van de tumorresectie, en eerder genoemde therapeutische aanpak, en overlevingsresultaten. inclusief progressievrije overleving (PFS) en algehele overleving (OS).

De NND-groep bestond uit 20 op geslacht afgestemde individuen die willekeurig werden gerekruteerd. De leeftijd varieerde van 4 tot 54 jaar, met een gelijke man-vrouwverhouding van 10 tot 10. Degenen die geen medicijnen ontvingen of aan een huidige of vroegere maligniteit leden.

Methoden, monsterverwerking: Voordat enige oncologische therapeutische aanpak werd toegepast, werden hersenspecimens operatief afgenomen met behulp van open stereotactische biopsietechniek, vervolgens bewaard in neutraal gebufferde formaline en gewikkeld in paraffine gekleurd met hematoxyline-eosine (HE). Een panel van neuropathologen beoordeelde vervolgens alle ingeschreven monsters om de diagnose te bevestigen in overeenstemming met de CNS Tumors WHO-classificatie van 2016.

Optimaliseren van de GBM-weefselkwaliteit voor nauwkeurige DNA-methylatieprofilering De volgende inclusiecriteria werden gebruikt om de GBM-weefselbrokken te kiezen: een histopathologische bevestiging van GBM-weefsel met minimaal 80% levensvatbare kwaadaardige cellen, evenals gearchiveerde in paraffine ingebedde weefselcoupes moeten gemakkelijk beschikbaar zijn beschikbaar. De daaropvolgende procedures werden uitgevoerd op alle GBM-weefsels: Een volledige plak van het in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) blok GBM-weefsels werd gesneden tot een dikte van 4 micron en vervolgens gekleurd met de standaard HE-kleuringen om de levensvatbaarheid te evalueren. van het gedoneerde kwaadaardige weefsel. Nieuw gesneden, tot 10 µm dikke FFPE-plakjes werden gebruikt om monsters voor te bereiden voor PCR-analyse.

DNA-extractie DNA werd geïsoleerd uit FFPE-monsters via een QIAamp FFPE-kit (Cat. nr. 56404, Valencia, CA), zoals voorgeschreven door de leverancier. Zuiverheid en concentratie werden bepaald via een nono-drop spectrofotometer (Quawell, Q-500, Scribner, VS) door het bepalen van de absorptie-intensiteit bij 260 en 280 nm en geverifieerd op een 1% agarosegel. De geïsoleerde DNA-monsters werden bij -20°C gehouden voor daaropvolgende analyse om de methyleringsniveaus van MGMT-, NUPR1-, NDRG2- en GLI1-genen te identificeren.

Detectie van MGMT-, NUPR1-, NDRG2- en GLI1-methylatiepatronen via Methyl II kwantitatieve PCR Methylatiepatronen van MGMT, NUPR1, NDRG2 en GLI1 zijn gedetecteerd in DNA-opgehaalde monsters met behulp van het EpiTect Methyl II kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) -systeem ( Qiagen, Duitsland). Dit wordt geverifieerd door het detecteren van de hoeveelheid geëxtraheerd DNA die overblijft na fragmentatie met behulp van methylatiespecifieke restrictie-enzymen. Vervolgens werd het resterende DNA gekwantificeerd door middel van real-time PCR met behulp van specifieke methyleringsprimers voor de beoogde genen die interessante promotergebieden bevatten.

3.3.1. Methyleringsspecifieke restrictie-enzymdigestietechniek De procedure werd in twee fasen uitgevoerd, waarbij bepaalde wijzigingen in ons laboratorium werden doorgevoerd. In Fase I werd de EpiTect Methyl II DNA Restriction Kit (cat. Nee. 335452) werd gebruikt voor de reacties. Genomisch DNA, dat eerder was geëxtraheerd, werd verdeeld in twee equivalente porties in twee afzonderlijke PCR-reactiebuizen; één buis had geen toegevoegd restrictie-enzym en de andere buis had een methyleringsgevoelig restrictie-enzym dat selectief ongemethyleerd DNA verteert. De buizen werden vervolgens onderworpen aan incubatie in een thermische cycler (SureCycler 8800, Agilent, Santa Clara, CA, VS) bij 37 ° C gedurende 6 uur, gevolgd door incubatie bij 65 ° C gedurende 20 minuten.

3.3.2. Kwantitatieve PCR (qPCR) analyse De kwantificering van de resterende genomische DNA-monsters in elke buis werd uitgevoerd in Fase II met behulp van een Max3005P qPCR-systeem (Stratagene, Agilent Technologies, CA, VS). Om deze fase te starten werd een hoeveelheid van 5 μl van het resterende DNA uit elke buis gemengd met de qPCR-mastermix (RT2 qPCR SYBR Green/ROX Master Mix, Cat. Nee. 330520). Het resulterende mengsel werd vervolgens in een PCR-plaat gebracht die vooraf in porties verdeelde MGMT-, NUPR1-, NDRG2- en GLI1-gemethyleerde en niet-gemethyleerde primers bevatte.

Statistische analyse De Mann-Whitney U-test werd gebruikt om de methyleringsniveaus van de vier genen in de twee groepen te vergelijken.

De optimale afkappunten voor promotermethylering van de vier genen werden bepaald nadat ze in (ROC)-curven waren uitgezet met behulp van het gemiddelde% methylering bij elke patiënt. Het gebied onder de curve (AUC) en de testnauwkeurigheid werden berekend.

Overlevingsgegevens (in maanden) werden berekend vanaf het begin van elke chemotherapielijn tot de datum van overlijden of de laatste follow-up. Verschillen in PFS en OS werden vergeleken met behulp van Kaplan-Meier-overlevingscurven, en de log-rank-test werd gebruikt om statistische significantie bepalen.

Het Cox-model voor proportionele gevaren werd gebruikt voor multivariate overlevingsanalyse. Cox-regressie-multivariate analyse werd uitgevoerd met behulp van een voorwaartse stapsgewijze parameter met een significantie van 0,05 voor toegang en 0,1 voor verwijdering van factoren die significant geassocieerd zijn met OS.

Het binaire logistische regressiemodel werd gebruikt om de prognostische betekenis van de methylering van de vier genen te analyseren; MGMT, NUPR1, GLI1 en NUPR1, geslacht, leeftijd, tumorgrootte en ECOG met betrekking tot klinische uitkomsten. De goodness-of-fit van de logistische regressiemodellen werd geëvalueerd met behulp van de Hosmer-Lemeshow-test.

Er werd gekozen voor een significantieniveau met een p-waarde kleiner dan 0,05. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Statistical package for social studies software (SPSS) versie 27.0 (IBM, Armonk, NY) en R Core Team (2023).