ガリラヤ医療センターの生化学検査室での血漿シュウ酸濃度の検証試験

体内のシュウ酸塩の供給源は、肝臓での内因性生成と栄養です。 シュウ酸塩は腎臓から尿中に排泄されます。 尿中にシュウ酸塩が過剰に存在する状況では、シュウ酸塩がカルシウムと一緒に結晶化し、腎臓内でシュウ酸カルシウム結晶として沈着し、腎臓障害を引き起こす可能性があります。 腎臓の損傷が進行すると、尿中のシュウ酸塩の分泌が障害され、シュウ酸塩が血液中に蓄積し、目、骨、骨髄、血管などを含む体のすべての組織に沈着します。 体内にシュウ酸塩濃度が高い状態は、中毒（エチレングリコール）や、嚢胞性線維症や炎症性腸疾患などの続発性高シュウ酸尿症（脂肪性下痢の場合、腸内でのシュウ酸塩の吸収が増加する）によって引き起こされます。 ）または原発性高シュウ酸尿症。

原発性高シュウ酸尿症は、肝臓のシュウ酸代謝経路の遺伝的欠陥により、肝臓からのシュウ酸排泄の増加によって引き起こされる一連の疾患です。 高シュウ酸尿症 1 型 (PH1) は、グループ全体の中で最も重度であり、ほとんどの患者が生後 20 年までに腎不全を引き起こします。 PH1 の治療は、最近まで正常な酵素を回復するための肝臓移植に基づいており、ほとんどの場合、腎臓移植も必要でした。 2021年11月、FDAは高シュウ酸尿症の画期的な治療薬LUMASIRANを承認した。

ガリラヤ医療センターの小児腎臓病棟は、高シュウ酸尿症の専門センターです。 ガリラヤ地方の人口におけるこの病気の発生率は世界で最も高いものの一つであり、その結果、当センターではこの病気の治療において多くの経験が蓄積されてきました。

また、小児腎臓病棟は、薬剤LUMASIRANの有効性と安全性をテストするためのALNYLAM社の臨床研究のセンターとして使用されました。 現在、8人のPH1患者が（研究または健康バスケットを通じて）新薬の投与を受けており、当院の小児腎臓病棟でモニタリングを受けている。

血漿中のシュウ酸濃度の検査は、主に高シュウ酸尿症患者の場合に必要であり、主に治療に対する反応を監視するため、または腎移植の決定に備えて行う目的で行われます。 上記のようにテストを実行することが重要な状況は他にもありますが、これはまれな状況です。 イスラエルには血漿中のシュウ酸濃度を検査する研究所はありません。

ガリラヤ医療センターの生化学研究室など、尿中のシュウ酸塩レベルの検査を行う研究室がいくつかあります。 尿検査は、高シュウ酸尿症が疑われる場合の初期調査として、また腎結石症の調査の一環として行われます。

PH1 に対する薬物治療が登場する前の期間、最終的な治療法は肝臓移植に基づいていましたが、イスラエルでは尿中のシュウ酸塩のみを監視するのが慣例でした。 米国や欧州では、肝移植後の血漿シュウ酸濃度を監視し、正常値に近い値まで低下した場合に腎移植を推奨する習慣があった。 故人から肝臓や腎臓を提供された場合、腎臓移植を遅らせることは許されず、イスラエルでは肝腎移植後、血漿シュウ酸濃度を監視しながら一定期間透析を行う施設もあった。前述したように、肝臓/肝臓腎臓移植後に透析を行うことは習慣的ではなく、移植後の血漿シュウ酸濃度を監視することも習慣的ではありませんでした。

新しい治療薬が承認されてから状況は変わりました。 ルミシレンは、2022年にイスラエルのすべてのPH1患者の医療バスケットに加わりました。 この治療は肝移植に代わるものであるため、以下の状況では血漿中のシュウ酸濃度を監視する必要があります。

1. 排尿していない透析患者におけるルムサイレン治療に対する反応を監視するため（したがって、尿中のシュウ酸塩の減少を監視することはできません）
2. ルムシランによる治療を受けている進行性腎不全のPH1患者の腎臓移植の準備中。 最新の推奨事項によると、腎臓移植の前に、血漿中のシュウ酸塩の値が 70 マイクロモル/リットル未満に減少するまで待つ必要があります。
3. ルメシレンで治療された患者の腎移植後、血漿中にシュウ酸濃度が高い場合のリスク評価と移植後の腎臓を保護するための透析の必要性を目的としています。

血漿中のシュウ酸塩の検査は、尿中のシュウ酸塩レベルの検査に比べて簡単ではありません。尿中の値は血漿よりも一桁高く（尿中の値はミリモル/リットル、血漿中マイクロモル/リットル）、また市販の検査もあるからです。高濃度では感度が高くなります。 さらに、シュウ酸塩は不安定です。比較的塩基性の環境 (pH>4) ではアスコルビン酸がシュウ酸塩に変化するため、試験準備段階で血漿の酸性化が必要です。

私たちの生化学研究室で尿中のシュウ酸塩を検査するために使用されるキットは、酵素シュウ酸オキシダーゼと呈色反応 (電量分析) に基づいており、Biotech Trinity から購入しました。 メーカーの説明書によれば、このキットは尿中のシュウ酸濃度を検査することを目的としています。 このテストは当社の実験室で実施され、メーカーの指示に従って内部検証を受けています。

世界中の検査機関では、血漿中のシュウ酸濃度の検査には 2 種類あります。TRINITY BIOTECH キットに基づく酵素検査と分光測光法を使用する検査機関と、質量分析法 (ガスまたはイオン) を使用する検査機関があります。

2 番目の方法 (質量分析法) は、血漿中のシュウ酸塩については正確であると考えられていますが、非常に高価であり、私たちの研究室では利用できません。 シュウ酸オキシダーゼ酵素の使用は、世界の主要な研究室の研究および臨床ニーズに受け入れられています。

ベルリンの CHARITE 大学病院の生化学研究室では、臨床および研究目的で血漿中のシュウ酸検査が広く使用されています。 CHARITE 病院の腎臓学研究室および部門は、高シュウ酸尿症の分野で世界のリーダーとみなされており、TRINITY キットの酵素法を使用して血漿シュウ酸塩を測定した研究を発表しています。

イスラエルでシュウ酸血漿検査を実施する必要性と、イスラエルの高シュウ酸尿症分野の主導的センターであることを考慮して、研究者らは当施設の生化学検査室で検査を実施することに興味を持っています。 ここの研究室で利用可能な手段に従って、シュウ酸オキシダーゼに基づく酵素検査の効率と信頼性をテストした後、研究者らは私たちの研究室でシュウ酸血漿検査を検証することを決定しました。 メーカーはキットを尿検査のみに指定しているため、メーカーの検査キットに基づいて検証を行うことはできず、研究者は外部検証を必要としました。 これまでに実施されたパイロットテストでは、研究者らは患者の臨床状態に応じて許容可能な値を取得しました。

ベルリンの CHARITE 病院の Knopf 教授は、私たちの生化学研究室で行われた血漿シュウ酸塩検査について、外部検証を行うことに寛大にも同意してくれました。

方法:

サンプル数: 30 人の異なる患者から合計 30 個の血液サンプルが採取されます。 幅広い血漿シュウ酸レベルを取得するために、サンプルはさまざまな患者から採取されます。 健康なボランティアから約10サンプル、高シュウ酸尿症の背景がない透析患者から約10サンプル、薬物治療中または肝移植後の高シュウ酸尿患者から約5サンプル、透析を受けていない進行腎不全患者から約5サンプルが採取される。

テストプロトコル - 付録に添付されています。 このプロトコルは、外部検証が実行される研究室と互換性があります。

各サンプルは直ちに滅菌され、血漿は 2 本の試験管に分けられ、冷凍保存されます (-80)。 1本の試験管はベルリンの実験室で検査するために送られ、もう1本の試験管はここに留まって私たちの研究室で検査されます。

サンプルを凍結するまで処理するステップは、ここで実行されるステップと同じです。

ここの実験室でのサンプル取り扱いプロセスは、実験室の従業員 1 名によって実行されます。

サンプルは冷凍してベルリンの研究所に送られる。 第 2 ステップである解凍後のサンプルの処理は、サンプルの処理における差異を避けるために、2 つの研究室間で合意されたプロトコールに従って実行されます。 また、冷凍庫でのサンプルの保存時間に起因する差異を避けるために、研究者は 2 つの研究室間で検査日を調整します。

このプロトコールは、ベルリンの研究室と私たちが共同で作成したものです。 サンプルの発送には、ガリラヤの高シュウ酸尿症患者への意識を高め、サービスを改善するプロジェクトへの支援の一環として、メディソン・ファーマシューティカルズが資金提供する予定です。

統計 - ベルリンからテストの回答を受け取った後、調査員は以下のテストを使用して、ベルリンで得られた結果とここで得られた結果を比較します。

定量的データは、平均値と標準偏差、中央値、四分位範囲 (IQR)、および範囲を使用して説明されます。

ペアのあるサンプルの比較検定 - ペアのあるサンプルの T 検定 (差異が正規分布している場合) またはウィルコクソンの符号付き順位検定 (差異の分布が正規でない場合) を使用して、2 つのペアのあるサンプル間の差異を調べます。 ペアになったサンプル間の差について 95% 信頼区間が計算されます。

相関テスト - ペアになったサンプル間の関係をテストします。 ピアソンの相関係数テストまたは代わりにスピアマンの相関係数テスト (サンプルのサイズと分布の形状に従って選択されます)、ブランド-アルトマン プロットおよび散布図曲線を使用して、結果間の差異を実証しました。

5% 未満の P 値は統計的に有意であるとみなされます。

匿名性の維持: フォームや試験管の詳細を特定することなく、サンプルにはここで指定されたコードがマークされます。 コーディングテーブルは、主任研究者のコンピュータ上と研究コーディネーターのクローゼット内の別のバインダーに別々に保管されます。

インフォームド・コンセント: ボランティアは、検査の意味について説明した後、インフォームド・コンセント用紙に署名します。