Prueba de validación del nivel de oxalato plasmático en un laboratorio bioquímico del Centro Médico Galilee

La fuente de oxalato en el cuerpo es la producción endógena en el hígado y la nutrición. El oxalato se excreta en la orina a través de los riñones. En situaciones en las que hay un exceso de oxalato en la orina, puede cristalizar junto con el calcio y asentarse como cristales de oxalato de calcio en el riñón y causar daño renal. Si hay daño renal avanzado, la secreción de oxalato en la orina se ve afectada y el oxalato se acumula en la sangre y se deposita en todos los tejidos del cuerpo, incluidos los ojos, los huesos, la médula ósea, los vasos sanguíneos y más. Las condiciones en las que hay un nivel alto de oxalato en el cuerpo son causadas por intoxicación (etilenglicol) o condiciones de hiperoxaluria secundaria como en la fibrosis quística o enfermedades inflamatorias del intestino (hay una mayor absorción de oxalato en el intestino en casos de diarrea grasa ) o en la hiperoxaluria primaria.

La hiperoxaluria primaria es un grupo de enfermedades causadas por una mayor excreción de oxalato por el hígado, debido a un defecto genético en la vía del metabolismo del oxalato en el hígado. La hiperoxaluria tipo 1 (PH1) es la más grave de todo el grupo y causa insuficiencia renal en la mayoría de los pacientes en la segunda década de la vida. Hasta hace poco, el tratamiento de PH1 se basaba en un trasplante de hígado para restablecer una enzima normal y, en la mayoría de los casos, también era necesario un trasplante de riñón. En noviembre de 2021, la FDA aprobó un fármaco innovador para la hiperoxaluria, LUMASIRAN.

La Unidad de Nefrología Pediátrica del Centro Médico Galilee es un centro especializado en hiperoxaluria. La incidencia de la enfermedad en la población de Galilea es una de las más altas del mundo y como resultado se ha acumulado mucha experiencia en el tratamiento de la enfermedad en nuestro centro.

Además, la unidad de nefrología pediátrica se utilizó como centro de investigación clínica de la empresa ALNYLAM para probar la eficacia y seguridad del fármaco LUMASIRAN. Actualmente son ocho los pacientes PH1 que reciben el nuevo fármaco (a través de investigación o de la canasta sanitaria) y que se encuentran en seguimiento en la unidad de nefrología pediátrica de nuestra institución.

La prueba del nivel de oxalato en plasma se requiere principalmente en casos de pacientes con hiperoxaluria, principalmente con el fin de monitorear la respuesta al tratamiento o en preparación para una decisión sobre un trasplante de riñón. Hay otras situaciones en las que es importante realizar la prueba como se mencionó anteriormente, pero son situaciones más raras. En Israel no existe ningún laboratorio que analice el nivel de oxalato en plasma.

Hay varios laboratorios, entre ellos el laboratorio de bioquímica del Centro Médico Galilee, que realizan una prueba del nivel de oxalato en la orina. El análisis de orina se realiza como examen inicial en situaciones en las que se sospecha hiperoxaluria y como parte de la investigación de la enfermedad de cálculos renales.

En el período anterior a la aparición del tratamiento farmacológico para el PH1, cuando el tratamiento definitivo se basaba en un trasplante de hígado, en Israel era costumbre controlar únicamente el oxalato en la orina. En EE.UU. y Europa, era costumbre controlar los niveles plasmáticos de oxalato después de un trasplante de hígado, y cuando el nivel descendía a un valor cercano a lo normal, se recomendaba proceder con un trasplante de riñón. En situaciones en las que el fallecido donaba un hígado y un riñón, no era aceptable retrasar el trasplante de riñón, y había centros que solían realizar diálisis durante un período determinado después del trasplante de hígado y riñón mientras se monitorizaban los niveles de oxalato en plasma. En Israel, como mencionado, no era habitual realizar diálisis después del trasplante de hígado/hígado-riñón y no era habitual controlar los niveles de oxalato en plasma después del trasplante.

La situación cambió tras la aprobación del nuevo tratamiento farmacológico. Lumisiren ingresó a la canasta de salud en Israel en 2022 para todos los pacientes de PH1. El tratamiento sustituye al trasplante de hígado y por ello existe la necesidad de controlar los niveles de oxalato en plasma en las siguientes situaciones:

1. Para controlar la respuesta al tratamiento con lumsiren en un paciente en diálisis que no orina (por lo tanto, no es posible controlar la disminución de oxalato en la orina)
2. En preparación para un trasplante de riñón en un paciente PH1 con insuficiencia renal avanzada que está siendo tratado con lumsiran. Según las últimas recomendaciones, es necesario esperar a que el oxalato en plasma disminuya a un valor inferior a 70 micromol/litro antes de un trasplante de riñón.
3. Después de un trasplante de riñón en un paciente tratado con lumesiren, con el fin de evaluar el riesgo y la necesidad de diálisis después del trasplante para proteger el riñón si existen niveles elevados de oxalato en plasma.

La prueba de oxalato en plasma no es sencilla en comparación con la prueba del nivel en orina porque los valores en orina son un orden de magnitud más altos que en plasma (en valores de orina de mmol/litro y en plasma de micromol/litro) y las pruebas disponibles en el mercado. son más sensibles a concentraciones más altas. Además, el oxalato es inestable: hay una transición del ácido ascórbico al oxalato en un ambiente relativamente básico (4pH>) y por lo tanto es necesaria la acidificación del plasma durante la fase de preparación de la prueba.

El kit utilizado para analizar el oxalato en orina en nuestro laboratorio bioquímico se basa en la enzima oxalato oxidasa y la reacción de color (coulométrica) y se adquirió en Biotech Trinity. Según las instrucciones del fabricante, el kit está destinado a comprobar el nivel de oxalato en la orina. Esta prueba se realiza en nuestro laboratorio y ha sido sometida a validación interna según las instrucciones del fabricante.

Existen dos tipos de pruebas para el nivel de oxalato en plasma en los laboratorios del mundo: hay laboratorios que utilizan la prueba enzimática basada en el kit TRINITY BIOTECH y espectrofotometría, y hay laboratorios que utilizan el método de espectrometría de masas (gas o iones).

El segundo método (espectrometría de masas) se considera preciso para el oxalato en plasma, pero es bastante caro y no está disponible en nuestro laboratorio. El uso de la enzima oxalato oxidasa está aceptado en investigación y para necesidades clínicas en laboratorios líderes del mundo.

En el laboratorio bioquímico del hospital universitario CHARITE de Berlín se utilizan ampliamente pruebas de oxalato en plasma con fines clínicos y de investigación. El Laboratorio y el Departamento de Nefrología del Hospital CHARITE son considerados líderes mundiales en el campo de la hiperoxaluria y publicaron estudios en los que se midió el oxalato plasmático con el método enzimático del kit TRINITY.

Dada la necesidad de realizar una prueba de oxalato en plasma en Israel y siendo un centro líder en el campo de la hiperoxaluria en Israel, los investigadores están interesados ​​en realizar la prueba en el laboratorio bioquímico de nuestra institución. De acuerdo con los medios de los que dispone el laboratorio y tras comprobar la eficacia y fiabilidad de la prueba enzimática basada en oxalato oxidasa, los investigadores decidieron validar la prueba de oxalato en plasma en nuestro laboratorio. Dado que el fabricante designa el kit solo para pruebas de orina, no es posible realizar una validación basada en los kits de prueba del fabricante y los investigadores necesitaron una validación externa. En las pruebas piloto realizadas hasta el momento, los investigadores han obtenido valores aceptables según el estado clínico del paciente.

El Prof. Knopf del Hospital CHARITE de Berlín aceptó generosamente realizar para nosotros una validación externa de la prueba de oxalato plasmático realizada en nuestro laboratorio bioquímico.

Métodos:

Número de muestras: se tomarán un total de 30 muestras de sangre, de 30 pacientes diferentes. Las muestras se tomarán de una variedad de pacientes para obtener una amplia gama de niveles de oxalato en plasma. Se tomarán unas 10 muestras de voluntarios sanos, unas 10 muestras de pacientes en diálisis sin antecedentes de hiperoxaluria, unas 5 muestras de pacientes con hiperoxaluria que reciben tratamiento farmacológico o después de un trasplante de hígado, y unas 5 muestras de pacientes con insuficiencia renal avanzada que no están en diálisis.

El protocolo de prueba, adjunto en el apéndice. El protocolo es compatible con el laboratorio donde se realizará la validación externa.

Cada muestra se esterilizará inmediatamente y el plasma se dividirá en dos tubos de ensayo y se mantendrá congelado (-80). Un tubo de ensayo se enviará al laboratorio de Berlín para su análisis y el otro se quedará aquí y se probará en nuestro laboratorio.

El paso de tratar la muestra hasta congelarla es el mismo que se realizará aquí.

El proceso de manipulación de muestras en el laboratorio aquí lo realizará un empleado del laboratorio.

Las muestras se enviarán congeladas al laboratorio de Berlín. El segundo paso, el tratamiento de la muestra tras la descongelación, se llevará a cabo según un protocolo acordado entre los dos laboratorios, con el fin de evitar diferencias en el tratamiento de la muestra. Además, los investigadores coordinarán los días de las pruebas entre los dos laboratorios para evitar diferencias derivadas del tiempo de conservación de las muestras en el congelador.

El protocolo lo redactamos conjuntamente con el laboratorio de Berlín. El envío de las muestras será financiado por Medison Pharmaceuticals como parte de su apoyo al proyecto para crear conciencia y mejorar el servicio a los pacientes con hiperoxaluria en Galilea.

Estadísticas: después de recibir las respuestas de las pruebas de Berlín, los investigadores compararán los resultados obtenidos allí y aquí utilizando las siguientes pruebas:

Los datos cuantitativos se describirán utilizando medias y desviaciones estándar, mediana, rango intercuartil (IQR) y rango.

Pruebas de comparación para muestras pareadas: para examinar las diferencias entre dos muestras pareadas utilizando la prueba T para muestras pareadas (si las diferencias se distribuyen normalmente) o la prueba de rangos con signo de Wilcoxon si la distribución de las diferencias no es normal. Se calculará un intervalo de confianza del 95% para la diferencia entre las muestras pareadas.

Pruebas de correlación: para probar la relación entre muestras pareadas. Se utilizaron la prueba del coeficiente de correlación de Pearson o, alternativamente, la prueba del coeficiente de correlación de Spearman (se elegirá según el tamaño de la muestra y la forma de la distribución). Se utilizaron curvas de diagrama de Bland-Altman y diagrama de dispersión para demostrar la diferencia entre los resultados.

Un valor de P inferior al 5% se considerará estadísticamente significativo.

Manteniendo el anonimato: las muestras serán marcadas con un código aquí proporcionado, sin datos identificativos en los formularios ni en los tubos de ensayo. La tabla de codificación se mantendrá por separado en la computadora del investigador principal y en una carpeta separada en el armario del coordinador de investigación.

Consentimiento informado: Los voluntarios firmarán un formulario de consentimiento informado después de una explicación del significado de la prueba.