Test de validation du niveau d'oxalate plasmatique dans un laboratoire biochimique du centre médical Galilée

La source d’oxalate dans l’organisme est la production endogène dans le foie et la nutrition. L'oxalate est excrété dans les urines par les reins. Dans les situations où il y a un excès d'oxalate dans l'urine, il peut cristalliser avec le calcium et se déposer sous forme de cristaux d'oxalate de calcium dans les reins et provoquer des lésions rénales. En cas de lésions rénales avancées, la sécrétion d'oxalate dans l'urine est altérée et l'oxalate s'accumule dans le sang et se dépose dans tous les tissus du corps, y compris les yeux, les os, la moelle osseuse, les vaisseaux sanguins, etc. Les affections dans lesquelles il existe un niveau élevé d'oxalate dans l'organisme sont causées par un empoisonnement (éthylène glycol) ou par des affections d'hyperoxalurie secondaire comme dans la mucoviscidose ou des maladies inflammatoires de l'intestin (il y a une absorption accrue de l'oxalate dans l'intestin en cas de diarrhée grasse). ) ou dans l'hyperoxalurie primaire.

L'hyperoxalurie primaire est un groupe de maladies causées par une excrétion accrue d'oxalate par le foie, en raison d'un défaut génétique dans la voie métabolique de l'oxalate dans le foie. L'hyperoxalurie de type 1 (PH1) est la plus grave de tout le groupe et provoque une insuffisance rénale chez la plupart des patients au cours de la deuxième décennie de la vie. Le traitement de l'HP1 reposait jusqu'à récemment sur une transplantation hépatique afin de restaurer une enzyme normale et, dans la plupart des cas, une transplantation rénale était également nécessaire. En novembre 2021, la FDA a approuvé un médicament révolutionnaire contre l’hyperoxalurie, LUMASIRAN.

L'unité de néphrologie pédiatrique du Centre Médical Galilée est un centre spécialisé dans l'hyperoxalurie. L'incidence de la maladie dans la population de Galilée est l'une des plus élevées au monde et, par conséquent, une grande expérience a été accumulée dans le traitement de la maladie dans notre centre.

En outre, l'unité de néphrologie pédiatrique a été utilisée comme centre de recherche clinique de la société ALNYLAM pour tester l'efficacité et l'innocuité du médicament LUMASIRAN. Ce sont désormais huit patients PH1 recevant le nouveau médicament (par la recherche ou via le panier santé) qui sont suivis dans l'unité de néphrologie pédiatrique de notre établissement.

Le test du taux d'oxalate dans le plasma est principalement nécessaire chez les patients atteints d'hyperoxalurie, principalement dans le but de surveiller la réponse au traitement ou de préparer une décision de transplantation rénale. Il existe d’autres situations dans lesquelles il est important d’effectuer le test mentionné ci-dessus, mais ce sont des situations plus rares. En Israël, il n'existe aucun laboratoire qui teste le niveau d'oxalate dans le plasma.

Il existe plusieurs laboratoires, parmi lesquels le laboratoire de biochimie du centre médical Galilée, qui effectuent un test du niveau d'oxalate dans l'urine. L'analyse d'urine est réalisée comme examen initial dans les situations où une hyperoxalurie est suspectée et dans le cadre de l'investigation des calculs rénaux.

Avant l’apparition du traitement médicamenteux de l’HP1, lorsque le traitement définitif reposait sur une greffe du foie, il était d’usage de ne surveiller que l’oxalate dans les urines en Israël. Aux États-Unis et en Europe, il était d'usage de surveiller les taux plasmatiques d'oxalate après une transplantation hépatique, et lorsque le taux tombait à une valeur proche de la normale, il était recommandé de procéder à une transplantation rénale. Dans les situations où un foie et un rein provenaient d'un défunt, il n'était pas acceptable de retarder la transplantation rénale, et il existait des centres qui effectuaient une dialyse pendant une certaine période après une transplantation foie-rein tout en surveillant les taux plasmatiques d'oxalate. En Israël, comme mentionné, il n’était pas habituel d’effectuer une dialyse après une transplantation hépatique/foie-rein et il n’était pas habituel de surveiller les taux plasmatiques d’oxalate après la transplantation.

La situation a changé après l’approbation du nouveau traitement médicamenteux. Lumisiren est entré dans le panier santé en Israël en 2022 pour tous les patients PH1. Le traitement remplace la greffe du foie et il est donc nécessaire de surveiller les taux d'oxalate dans le plasma dans les situations suivantes :

1. Pour surveiller la réponse au traitement par lumsiren chez un patient dialysé qui n'urine pas (il n'est donc pas possible de surveiller la diminution de l'oxalate dans les urines)
2. En préparation d'une greffe de rein chez un patient PH1 atteint d'insuffisance rénale avancée et traité par lumsiran. Selon les dernières recommandations, il faut attendre la diminution de l'oxalate dans le plasma jusqu'à une valeur inférieure à 70 micromoles/litre avant une greffe de rein.
3. Après une greffe de rein chez un patient traité par lumesiren, aux fins d'évaluation des risques et de la nécessité d'une dialyse après la greffe afin de protéger le rein en cas de taux élevés d'oxalate dans le plasma.

Le test de l'oxalate dans le plasma n'est pas simple par rapport au test du taux dans l'urine car les valeurs dans l'urine sont d'un ordre de grandeur plus élevées que dans le plasma (dans les valeurs urinaires de mmol/litre et dans le plasma micromol/litre) et les tests disponibles sur le marché. sont plus sensibles aux concentrations les plus élevées. De plus, l'oxalate est instable : il y a une transition de l'acide ascorbique en oxalate dans un environnement relativement basique (4pH>) et donc une acidification du plasma est nécessaire pendant la phase de préparation du test.

Le kit utilisé pour tester l'oxalate dans l'urine dans notre laboratoire biochimique est basé sur l'enzyme oxalate oxydase et la réaction colorée (coulométrique) et a été acheté chez Biotech Trinity. Selon les instructions du fabricant, le kit est destiné à tester le niveau d'oxalate dans l'urine. Ce test est réalisé dans notre laboratoire et a fait l'objet d'une validation interne selon les instructions du fabricant.

Il existe deux types de tests pour le taux d'oxalate dans le plasma dans les laboratoires du monde : il existe des laboratoires qui utilisent le test enzymatique basé sur le kit TRINITY BIOTECH et la spectrophotométrie, et il existe des laboratoires qui utilisent la méthode de spectrométrie de masse (gaz ou ions).

La deuxième méthode (spectrométrie de masse) est considérée comme précise pour l'oxalate dans le plasma mais est assez coûteuse et n'est pas disponible dans notre laboratoire. L'utilisation de l'enzyme oxalate oxydase est acceptée en recherche et pour les besoins cliniques des principaux laboratoires du monde.

Dans le laboratoire biochimique de l'hôpital universitaire CHARITE de Berlin, les tests d'oxalate dans le plasma sont largement utilisés à des fins cliniques et de recherche. Le laboratoire et le service de néphrologie de l'hôpital CHARITE sont considérés comme des leaders mondiaux dans le domaine de l'hyperoxalurie et ont publié des études dans lesquelles l'oxalate plasmatique a été mesuré avec la méthode enzymatique du kit TRINITY.

Compte tenu de la nécessité d'effectuer un test de plasma d'oxalate en Israël et étant un centre leader dans le domaine de l'hyperoxalurie en Israël, les enquêteurs sont intéressés à placer le test dans le laboratoire biochimique de notre institution. Conformément aux moyens dont dispose ici le laboratoire et après avoir testé l'efficacité et la fiabilité du test enzymatique à base d'oxalate oxydase, les enquêteurs ont décidé de valider le test plasmatique d'oxalate dans notre laboratoire. Étant donné que le fabricant désigne le kit uniquement pour les tests d'urine, il n'est pas possible d'effectuer une validation basée sur les kits de test du fabricant et les enquêteurs avaient besoin d'une validation externe. Dans les tests pilotes menés jusqu'à présent, les enquêteurs ont obtenu des valeurs acceptables en fonction de l'état clinique du patient.

Le professeur Knopf de l'hôpital CHARITE de Berlin a généreusement accepté d'effectuer pour nous une validation externe du test d'oxalate plasmatique effectué dans notre laboratoire biochimique.

Méthodes :

Nombre d'échantillons : un total de 30 échantillons de sang seront prélevés, sur 30 patients différents. Les échantillons seront prélevés sur une variété de patients afin d'obtenir une large gamme de taux plasmatiques d'oxalate. Environ 10 échantillons seront prélevés sur des volontaires sains, environ 10 échantillons sur des patients dialysés sans antécédents d'hyperoxalurie, environ 5 échantillons sur des patients hyperoxalurie recevant un traitement médicamenteux ou après une transplantation hépatique, et environ 5 échantillons provenant de patients atteints d'insuffisance rénale avancée non dialysés.

Le protocole de test - joint en annexe. Le protocole est compatible avec le laboratoire où sera effectuée la validation externe.

Chaque échantillon sera stérilisé immédiatement et le plasma sera divisé en deux tubes à essai et conservé congelé (-80). Un tube à essai sera envoyé pour test au laboratoire de Berlin et un tube à essai restera ici et sera testé dans notre laboratoire.

L’étape de traitement de l’échantillon jusqu’à congélation est la même que celle qui sera réalisée ici.

Le processus de manipulation des échantillons dans le laboratoire sera effectué par un seul employé du laboratoire.

Les échantillons seront envoyés congelés au laboratoire de Berlin. La deuxième étape - le traitement de l'échantillon après décongélation - sera réalisée selon un protocole convenu entre les deux laboratoires, afin d'éviter des différences dans le traitement de l'échantillon. De plus, les enquêteurs coordonneront les jours des tests entre les deux laboratoires afin d'éviter une différence liée au temps de conservation des échantillons au congélateur.

Le protocole a été rédigé conjointement par nos soins avec le laboratoire de Berlin. L'envoi des échantillons sera financé par Medison Pharmaceuticals dans le cadre de son soutien au projet de sensibilisation et d'amélioration du service aux patients atteints d'hyperoxalurie en Galilée.

Statistiques - après avoir reçu les réponses aux tests de Berlin, les enquêteurs compareront les résultats obtenus là-bas et ici en utilisant les tests suivants :

Les données quantitatives seront décrites en utilisant les moyennes et les écarts types, la médiane, l'intervalle interquartile (IQR) et l'intervalle.

Tests de comparaison pour échantillons appariés - pour examiner les différences entre deux échantillons appariés à l'aide du test T pour échantillons appariés (si les différences sont normalement distribuées) ou du test de rang signé de Wilcoxon si la distribution des différences n'est pas normale. Un intervalle de confiance de 95 % sera calculé pour la différence entre les échantillons appariés.

Tests de corrélation - pour tester la relation entre les échantillons appariés. Test du coefficient de corrélation de Pearson ou alternativement test du coefficient de corrélation de Spearman (sera choisi en fonction de la taille de l'échantillon et de la forme de la distribution). Les courbes de tracé de Bland-Altman et de nuage de points ont été utilisées pour démontrer la différence entre les résultats.

Une valeur P inférieure à 5 % sera considérée comme statistiquement significative.

Préservation de l'anonymat : les échantillons seront marqués d'un code indiqué ici, sans mention d'identification sur les formulaires ou les éprouvettes. Le tableau de codage sera conservé séparément sur l'ordinateur du chercheur principal et dans un classeur séparé dans le placard du coordonnateur de recherche.

Consentement éclairé : Les volontaires signeront un formulaire de consentement éclairé après une explication de la signification du test.