Valideringstest for plasmaoksalatnivå i et biokjemisk laboratorium ved Galilee Medical Center

Kilden til oksalat i kroppen er endogen produksjon i leveren og ernæring. Oksalaten skilles ut i urinen via nyrene. I situasjoner hvor det er overskudd av oksalat i urinen, kan det krystallisere sammen med kalsium og legge seg som kalsiumoksalatkrystaller i nyren og forårsake nyreskade. Hvis det er fremskreden nyreskade, svekkes utskillelsen av oksalat i urinen, og oksalatet samler seg i blodet og avleires i alle kroppens vev, inkludert øyne, bein, benmarg, blodårer med mer. Tilstander der det er et høyt nivå av oksalat i kroppen er forårsaket av forgiftning (etylenglykol) eller tilstander med sekundær hyperoksaluri som ved cystisk fibrose eller inflammatoriske tarmsykdommer (det er økt absorpsjon av oksalat i tarmen i tilfeller av fettdiaré ) eller ved primær hyperoksaluri.

Primær hyperoksaluri er en gruppe sykdommer forårsaket av økt utskillelse av oksalat i leveren, på grunn av en genetisk defekt i oksalatmetabolismen i leveren. Hyperoksaluri type 1 (PH1) er den mest alvorlige av hele gruppen, og forårsaker nyresvikt hos de fleste pasienter innen det andre tiåret av livet. Behandlingen av PH1 var inntil nylig basert på en levertransplantasjon for å gjenopprette et normalt enzym, og i de fleste tilfeller var det også nødvendig med en nyretransplantasjon. I november 2021 godkjente FDA et banebrytende legemiddel for hyperoksaluri, LUMASIRAN.

Pediatrisk nefrologisk enhet ved Galilee Medical Center er et spesialistsenter for hyperoksaluri. Forekomsten av sykdommen i befolkningen i Galilea er en av de høyeste i verden og som et resultat er det samlet mye erfaring med behandling av sykdommen i vårt senter.

Den pediatriske nefrologienheten ble også brukt som et senter i ALNYLAM-selskapets kliniske forskning for å teste effektiviteten og sikkerheten til stoffet LUMASIRAN. Det er nå åtte PH1-pasienter som får det nye legemidlet (gjennom forskning eller gjennom helsekurven) som overvåkes i pediatrisk nefrologisk enhet ved vår institusjon.

Testing av oksalatnivået i plasma er hovedsakelig nødvendig i tilfeller av hyperoksaluripasienter, hovedsakelig for å overvåke responsen på behandlingen eller som forberedelse til en beslutning om nyretransplantasjon. Det er andre situasjoner der det er viktig å utføre testen som nevnt ovenfor, men dette er sjeldnere situasjoner. I Israel er det ikke noe laboratorium som tester nivået av oksalat i plasma.

Det er flere laboratorier, blant dem biokjemilaboratoriet ved Galilee Medical Center, som utfører en oksalatnivåtest i urinen. Urinprøven utføres som en innledende kartlegging i situasjoner hvor det er mistanke om hyperoksaluri og som en del av utredning av nyresteinsykdom.

I perioden før dukket opp medikamentell behandling for PH1, da den definitive behandlingen var basert på en levertransplantasjon, var det vanlig å overvåke kun oksalat i urinen i Israel. I USA og Europa var det vanlig å overvåke plasmaoksalatnivåer etter en levertransplantasjon, og når nivået falt til en verdi nær normalen, ble det anbefalt å gå videre med en nyretransplantasjon. I situasjoner der en lever og nyre ble donert fra den avdøde, var det ikke akseptabelt å utsette nyretransplantasjonen, og det var sentre som pleide å utføre dialyse i en viss periode etter lever-nyretransplantasjon mens man overvåket plasmaoksalatnivåer i Israel, som nevnt, var det ikke vanlig å utføre dialyse etter lever/lever-nyretransplantasjon og det var ikke vanlig å overvåke plasmaoksalatnivåer etter transplantasjon.

Situasjonen endret seg etter godkjenningen av den nye medikamentelle behandlingen. Lumisiren kom inn i helsekurven i Israel i 2022 for alle PH1-pasienter. Behandlingen erstatter levertransplantasjonen og som et resultat er det behov for å overvåke oksalatnivåer i plasma i følgende situasjoner:

1. For å overvåke responsen på lumsirenbehandling hos en dialysepasient som ikke tisser (det er derfor ikke mulig å overvåke reduksjonen i oksalat i urinen)
2. Som forberedelse til en nyretransplantasjon hos en PH1-pasient med avansert nyresvikt som behandles med lumsiran. I følge de siste anbefalingene er det nødvendig å vente på reduksjonen av oksalat i plasma til en verdi lavere enn 70 mikromol/liter før en nyretransplantasjon
3. Etter nyretransplantasjon hos pasient behandlet med lumesiren, for risikovurdering og behov for dialyse etter transplantasjonen for å beskytte nyren dersom det er høye nivåer av oksalat i plasma.

Å teste oksalat i plasma er ikke enkelt sammenlignet med å teste nivået i urin fordi verdiene i urin er en størrelsesorden høyere enn i plasma (i urinverdier på mmol/liter og i plasma mikromol/liter) og testene som er tilgjengelige på markedet er mer følsomme ved høyere konsentrasjoner. I tillegg er oksalat ustabilt: det er en overgang av askorbinsyre til oksalat i et relativt basisk miljø (4pH>), og derfor er det nødvendig med surgjøring av plasmaet under testforberedelsesfasen.

Settet som brukes til å teste oksalat i urin i vårt biokjemiske laboratorium er basert på enzymet oksalatoksidase og fargereaksjon (coulometrisk) og ble kjøpt fra Biotech Trinity. I følge produsentens instruksjoner er settet beregnet på å teste oksalatnivået i urin. Denne testen er utført i vårt laboratorium og har gjennomgått intern validering i henhold til produsentens instruksjoner.

Det finnes to typer tester for oksalatnivå i plasma i laboratorier i verden – Det finnes laboratorier som bruker den enzymatiske testen basert på TRINITY BIOTECH-settet og spektrofotometri, og det finnes laboratorier som bruker massespektrometrimetoden (gass eller ioner).

Den andre metoden (massespektrometri) anses som nøyaktig for oksalat i plasma, men er ganske dyr og ikke tilgjengelig for vårt laboratorium. Bruken av oksalatoksidase-enzym er akseptert i forskning og for kliniske behov i ledende laboratorier i verden.

I det biokjemiske laboratoriet ved CHARITE universitetssykehus i Berlin er det utstrakt bruk av oksalat-tester i plasma til kliniske og forskningsformål. Nefrologilaboratoriet og avdelingen ved CHARITE Hospital regnes som verdensledende innen hyperoksaluri, og publiserte studier der plasmaoksalat ble målt med den enzymatiske metoden i TRINITY-settet.

Gitt behovet for å utføre en oksalatplasmatest i Israel, og å være et ledende senter innen hyperoksaluri i Israel, er etterforskerne interessert i å plassere testen i det biokjemiske laboratoriet ved vår institusjon. I samsvar med midlene tilgjengelig for laboratoriet her og etter å ha testet effektiviteten og påliteligheten til den enzymatiske testen basert på oksalatoksidase, bestemte etterforskerne seg for å validere oksalatplasmatesten i vårt laboratorium. Siden produsenten utpeker settet kun for urintesting, er det ikke mulig å utføre validering basert på produsentens testsett, og etterforskerne trengte ekstern validering. I pilottestene som er kjørt så langt, har etterforskerne fått akseptable verdier i henhold til pasientens kliniske tilstand.

Prof. Knopf fra CHARITE Hospital i Berlin gikk sjenerøst med på å utføre en ekstern validering for oss for plasmaoksalattesten utført i vårt biokjemiske laboratorium.

Metoder:

Antall prøver: det vil bli tatt totalt 30 blodprøver fra 30 forskjellige pasienter. Prøvene vil bli tatt fra en rekke pasienter for å oppnå et bredt spekter av plasmaoksalatnivåer. Det skal tas ca. 10 prøver fra friske frivillige, ca. 10 prøver fra dialysepasienter uten bakgrunn av hyperoksaluri, ca. 5 prøver fra hyperoksaluripasienter som får medikamentell behandling eller etter en levertransplantasjon, og ca. 5 prøver fra avanserte nyresviktpasienter som ikke er i dialyse.

Testprotokollen - vedlagt i vedlegg. Protokollen er kompatibel med laboratoriet der den eksterne valideringen skal utføres.

Hver prøve steriliseres umiddelbart og plasmaet deles i to reagensglass og holdes frosset (-80). Ett reagensrør vil bli sendt til testing i laboratoriet i Berlin og ett reagensrør vil bli her og testes i vårt laboratorium.

Trinnet med å behandle prøven til frysing er det samme som det vil bli utført her.

Prøvehåndteringsprosessen i laboratoriet her vil bli utført av en laboratorieansatt.

Prøvene vil bli sendt frosne til laboratoriet i Berlin. Det andre trinnet - behandling av prøven etter tining - vil bli utført i henhold til en avtalt protokoll mellom de to laboratoriene, for å unngå forskjeller i behandlingen av prøven. Etterforskerne vil også koordinere dagene for testene mellom de to laboratoriene for å unngå forskjeller som oppstår fra bevaringstiden for prøvene i fryseren.

Protokollen ble skrevet i fellesskap av oss med laboratoriet i Berlin. Forsendelsen av prøvene vil bli finansiert av Medison Pharmaceuticals som en del av deres støtte til prosjektet for å øke bevisstheten og forbedre tjenesten for hyperoksaluripasienter i Galilea.

Statistikk - etter å ha mottatt testsvarene fra Berlin, vil etterforskerne sammenligne resultatene oppnådd der og her ved å bruke følgende tester:

Kvantitative data vil bli beskrevet ved bruk av gjennomsnitt og standardavvik, median, interkvartilt område (IQR) og område.

Sammenligningstester for parede prøver - for å undersøke forskjellene mellom to sammenkoblede prøver ved å bruke den sammenkoblede prøven T-testen (hvis forskjellene er normalfordelt) eller Wilcoxon signerte rangeringstest hvis fordelingen av forskjellene ikke er normal. Et 95 % konfidensintervall vil bli beregnet for forskjellen mellom de sammenkoblede prøvene.

Korrelasjonstester - for å teste forholdet mellom de sammenkoblede prøvene. Pearsons korrelasjonskoeffisienttest eller alternativt Spearmans korrelasjonskoeffisienttest (vil velges i henhold til utvalgets størrelse og formen på fordelingen) Bland-Altman plot og Scatter plot kurver ble brukt for å demonstrere forskjellen mellom resultatene.

En P-verdi lavere enn 5 % vil anses som statistisk signifikant.

Opprettholde anonymitet: Prøvene vil merkes med en kode gitt her, uten identifiserende detaljer på skjemaene eller reagensglassene. Kodetabellen oppbevares separat på rektors datamaskin og i egen perm i forskningskoordinatorens skap.

Informert samtykke: De frivillige vil signere et informert samtykkeskjema etter en forklaring av testens betydning.