Valideringstest for plasmaoxalatniveau i et biokemisk laboratorium på Galilee Medical Center

Kilden til oxalat i kroppen er endogen produktion i leveren og ernæring. Oxalatet udskilles i urinen via nyrerne. I situationer, hvor der er overskydende oxalat i urinen, kan det krystallisere sammen med calcium og sætte sig som calcium-oxalatkrystaller i nyren og give nyreskade. Hvis der er fremskreden nyreskade, forringes udskillelsen af ​​oxalat i urinen, og oxalatet ophobes i blodet og aflejres i alle kroppens væv, herunder øjne, knogler, knoglemarv, blodkar med mere. Tilstande, hvor der er et højt niveau af oxalat i kroppen, er forårsaget af forgiftning (ethylenglycol) eller tilstande med sekundær hyperoxaluri såsom cystisk fibrose eller inflammatoriske tarmsygdomme (der er øget absorption af oxalat i tarmen i tilfælde af fedtdiarré ) eller ved primær hyperoxaluri.

Primær hyperoxaluri er en gruppe af sygdomme forårsaget af øget udskillelse af oxalat i leveren på grund af en genetisk defekt i oxalatmetabolismevejen i leveren. Hyperoxaluri type 1 (PH1) er den mest alvorlige af hele gruppen og forårsager nyresvigt hos de fleste patienter i det andet årti af livet. Behandlingen af ​​PH1 var indtil for nylig baseret på en levertransplantation for at genoprette et normalt enzym, og i de fleste tilfælde var det også nødvendigt med en nyretransplantation. I november 2021 godkendte FDA et banebrydende lægemiddel mod hyperoxaluri, LUMASIRAN.

Den pædiatriske nefrologiske enhed på Galilee Medical Center er et specialistcenter for hyperoxaluri. Forekomsten af ​​sygdommen i befolkningen i Galilæa er en af ​​de højeste i verden, og som følge heraf er der oparbejdet megen erfaring med behandling af sygdommen i vores center.

Den pædiatriske nefrologiske enhed blev også brugt som et center i ALNYLAM-virksomhedens kliniske forskning for at teste effektiviteten og sikkerheden af ​​lægemidlet LUMASIRAN. Der er nu otte PH1-patienter, der får det nye lægemiddel (gennem forskning eller gennem sundhedskurven), som bliver overvåget på den pædiatriske nefrologiske enhed på vores institution.

Test af oxalatniveauet i plasma er hovedsageligt påkrævet i tilfælde af hyperoxaluripatienter, hovedsageligt med det formål at overvåge responsen på behandlingen eller som forberedelse til en beslutning om en nyretransplantation. Der er andre situationer, hvor det er vigtigt at udføre testen som nævnt ovenfor, men det er sjældnere situationer. I Israel er der intet laboratorium, der tester niveauet af oxalat i plasma.

Der er flere laboratorier, blandt dem det biokemiske laboratorium på Galilee Medical Center, der udfører en oxalatniveautest i urinen. Urinprøven udføres som en indledende undersøgelse i situationer, hvor der er mistanke om hyperoxaluri og som led i udredning af nyrestenssygdom.

I perioden før fremkomsten af ​​lægemiddelbehandlingen for PH1, hvor den endelige behandling var baseret på en levertransplantation, var det sædvanligt kun at overvåge oxalat i urinen i Israel. I USA og Europa var det sædvanligt at monitorere plasmaoxalatniveauer efter en levertransplantation, og da niveauet faldt til en værdi tæt på det normale, blev det anbefalet at gå videre med en nyretransplantation. I situationer, hvor en lever og en nyre blev doneret fra afdøde, var det ikke acceptabelt at udskyde nyretransplantationen, og der var centre, der plejede at udføre dialyse i en vis periode efter lever-nyretransplantation, mens man overvågede plasmaoxalatniveauer i Israel, som f.eks. nævnte, var det ikke sædvanligt at udføre dialyse efter lever/lever-nyre transplantation, og det var ikke sædvanligt at monitorere plasma oxalat niveauer efter transplantation.

Situationen ændrede sig efter godkendelsen af ​​den nye lægemiddelbehandling. Lumisiren kom ind i sundhedskurven i Israel i 2022 for alle PH1-patienter. Behandlingen erstatter levertransplantationen, og som følge heraf er der behov for at overvåge oxalatniveauer i plasma i følgende situationer:

1. At overvåge responsen på lumsirenbehandling hos en dialysepatient, der ikke tisser (det er derfor ikke muligt at overvåge faldet i oxalat i urinen)
2. Som forberedelse til en nyretransplantation hos en PH1 patient med fremskreden nyresvigt, som er i behandling med lumsiran. Ifølge de seneste anbefalinger er det nødvendigt at vente på faldet af oxalat i plasmaet til en værdi lavere end 70 mikromol/liter før en nyretransplantation
3. Efter en nyretransplantation hos en patient behandlet med lumesiren, med henblik på risikovurdering og behov for dialyse efter transplantationen for at beskytte nyren, hvis der er høje niveauer af oxalat i plasmaet.

At teste oxalat i plasma er ikke let sammenlignet med at teste niveauet i urin, fordi værdierne i urin er en størrelsesorden højere end i plasma (i urinværdier på mmol/liter og i plasma mikromol/liter) og de test, der er tilgængelige på markedet er mere følsomme ved de højere koncentrationer. Derudover er oxalat ustabilt: der sker en overgang af ascorbinsyre til oxalat i et relativt basisk miljø (4pH>), og derfor er forsuring af plasma påkrævet under testforberedelsesfasen.

Sættet, der bruges til at teste oxalat i urin i vores biokemiske laboratorium, er baseret på enzymet oxalatoxidase og farvereaktion (coulometrisk) og er købt hos Biotech Trinity. Ifølge producentens instruktioner er sættet beregnet til at teste oxalatniveauet i urin. Denne test udføres i vores laboratorium og har gennemgået intern validering i henhold til producentens instruktioner.

Der findes to typer test for oxalatniveau i plasma i laboratorier i verden – Der er laboratorier, der bruger den enzymatiske test baseret på TRINITY BIOTECH kit og spektrofotometri, og der er laboratorier, der bruger massespektrometrimetoden (gas eller ioner).

Den anden metode (massespektrometri) anses for nøjagtig for oxalat i plasma, men er ret dyr og ikke tilgængelig for vores laboratorium. Brugen af ​​oxalatoxidase-enzym er accepteret i forskning og til kliniske behov i førende laboratorier i verden.

I det biokemiske laboratorium på CHARITE Universitetshospital i Berlin er der udstrakt brug af oxalattest i plasma til kliniske og forskningsmæssige formål. Nefrologilaboratoriet og afdelingen på CHARITE Hospital anses for at være verdens førende inden for hyperoxaluri, og publicerede undersøgelser, hvor plasmaoxalat blev målt med den enzymatiske metode i TRINITY-sættet.

I betragtning af behovet for at udføre en oxalatplasmatest i Israel, og da de er et førende center inden for hyperoxaluri i Israel, er efterforskerne interesserede i at placere testen i det biokemiske laboratorium på vores institution. I overensstemmelse med de midler, der er til rådighed for laboratoriet her, og efter at have testet effektiviteten og pålideligheden af ​​den enzymatiske test baseret på oxalatoxidase, besluttede efterforskerne at validere oxalatplasmatesten i vores laboratorium. Da producenten kun udpeger sættet til urintestning, er det ikke muligt at udføre validering baseret på producentens testsæt, og efterforskerne havde brug for ekstern validering. I de hidtil kørte pilottests har efterforskerne modtaget acceptable værdier i henhold til patientens kliniske tilstand.

Prof. Knopf fra CHARITE Hospital i Berlin indvilligede generøst i at udføre en ekstern validering for os til plasmaoxalattesten udført i vores biokemiske laboratorium.

Metoder:

Antal prøver: Der vil blive taget i alt 30 blodprøver fra 30 forskellige patienter. Prøverne vil blive taget fra en række patienter for at opnå en bred vifte af plasmaoxalatniveauer. Der vil blive taget omkring 10 prøver fra raske frivillige, omkring 10 prøver fra dialysepatienter uden baggrund af hyperoxaluri, omkring 5 prøver fra hyperoxaluripatienter, der modtager lægemiddelbehandling eller efter en levertransplantation, og omkring 5 prøver fra fremskredne nyresvigtpatienter, der ikke er i dialyse.

Testprotokollen - vedhæftet i bilaget. Protokollen er kompatibel med laboratoriet, hvor den eksterne validering vil blive udført.

Hver prøve steriliseres med det samme, og plasmaet deles i to reagensglas og opbevares frosset (-80). Et reagensglas vil blive sendt til test i laboratoriet i Berlin og et reagensglas vil blive her og blive testet i vores laboratorium.

Trinnet med at behandle prøven indtil frysning er det samme, som det vil blive udført her.

Prøvehåndteringsprocessen i laboratoriet her vil blive udført af én laboratoriemedarbejder.

Prøverne sendes frosset til laboratoriet i Berlin. Det andet trin - behandling af prøven efter optøning - vil blive udført i henhold til en aftalt protokol mellem de to laboratorier, for at undgå forskelle i behandlingen af ​​prøven. Efterforskerne vil også koordinere dagene for testene mellem de to laboratorier for at undgå forskelle, der opstår som følge af opbevaringstiden for prøverne i fryseren.

Protokollen er skrevet i fællesskab af os med laboratoriet i Berlin. Forsendelsen af ​​prøverne vil blive finansieret af Medison Pharmaceuticals som en del af dets støtte til projektet for at øge bevidstheden og forbedre servicen til hyperoxaluripatienter i Galilæa.

Statistik - efter at have modtaget testsvarene fra Berlin, vil efterforskerne sammenligne resultaterne opnået der og her ved hjælp af følgende test:

Kvantitative data vil blive beskrevet ved hjælp af middelværdier og standardafvigelser, median, interkvartilområde (IQR) og interval.

Sammenligningstest for parrede prøver - for at undersøge forskellene mellem to parrede prøver ved hjælp af den parrede prøve T-test (hvis forskellene er normalfordelte) eller Wilcoxon signed rank test, hvis fordelingen af ​​forskellene ikke er normal. Et 95 % konfidensinterval vil blive beregnet for forskellen mellem de parrede prøver.

Korrelationstest - for at teste forholdet mellem de parrede prøver. Pearsons korrelationskoefficienttest eller alternativt Spearmans korrelationskoefficienttest (vil blive valgt i henhold til prøvens størrelse og fordelingens form) Bland-Altman plot og Scatter plot kurver blev brugt til at demonstrere forskellen mellem resultaterne.

En P-værdi lavere end 5 % vil blive betragtet som statistisk signifikant.

Opretholdelse af anonymitet: Prøverne vil blive markeret med en kode angivet her, uden at identificere detaljer på formularerne eller reagensglassene. Kodningstabellen opbevares separat på hovedforskerens computer og i et særskilt bind i forskningskoordinatorens skab.

Informeret samtykke: De frivillige vil underskrive en informeret samtykkeformular efter en forklaring af testens betydning.