Validierungstest für den Plasmaoxalatspiegel in einem biochemischen Labor am Galilee Medical Center

Die Oxalatquelle im Körper ist die endogene Produktion in der Leber und in der Ernährung. Das Oxalat wird über die Nieren mit dem Urin ausgeschieden. In Situationen, in denen überschüssiges Oxalat im Urin vorhanden ist, kann es zusammen mit Kalzium kristallisieren und sich als Kalziumoxalatkristalle in der Niere absetzen und Nierenschäden verursachen. Bei einer fortgeschrittenen Nierenschädigung ist die Sekretion von Oxalat im Urin beeinträchtigt, und das Oxalat reichert sich im Blut an und lagert sich in allen Geweben des Körpers ab, einschließlich Augen, Knochen, Knochenmark, Blutgefäßen und mehr. Zustände, bei denen ein hoher Oxalatspiegel im Körper vorliegt, werden durch Vergiftungen (Ethylenglykol) oder Zustände einer sekundären Hyperoxalurie wie bei Mukoviszidose oder entzündlichen Darmerkrankungen (bei fetthaltigem Durchfall kommt es zu einer erhöhten Oxalataufnahme im Darm) verursacht ) oder bei primärer Hyperoxalurie.

Primäre Hyperoxalurie ist eine Gruppe von Erkrankungen, die durch eine erhöhte Oxalatausscheidung durch die Leber aufgrund eines genetischen Defekts im Oxalatstoffwechselweg in der Leber verursacht werden. Hyperoxalurie Typ 1 (PH1) ist die schwerste der gesamten Gruppe und führt bei den meisten Patienten im zweiten Lebensjahrzehnt zu Nierenversagen. Die Behandlung von PH1 basierte bis vor kurzem auf einer Lebertransplantation, um ein normales Enzym wiederherzustellen, und in den meisten Fällen war auch eine Nierentransplantation erforderlich. Im November 2021 genehmigte die FDA ein bahnbrechendes Medikament gegen Hyperoxalurie, LUMASIRAN.

Die Abteilung für pädiatrische Nephrologie am Galilee Medical Center ist ein Spezialzentrum für Hyperoxalurie. Die Inzidenz der Krankheit in der Bevölkerung in Galiläa ist eine der höchsten weltweit, weshalb in unserem Zentrum viel Erfahrung in der Behandlung der Krankheit gesammelt wurde.

Außerdem wurde die Abteilung für pädiatrische Nephrologie als Zentrum für die klinische Forschung des Unternehmens ALNYLAM genutzt, um die Wirksamkeit und Sicherheit des Medikaments LUMASIRAN zu testen. Derzeit erhalten acht PH1-Patienten das neue Medikament (durch Forschung oder über den Gesundheitskorb) und werden in der pädiatrischen Nephrologieabteilung unserer Einrichtung überwacht.

Die Bestimmung des Oxalatspiegels im Plasma ist vor allem bei Hyperoxalurie-Patienten erforderlich, hauptsächlich zur Überwachung des Ansprechens auf die Behandlung oder zur Vorbereitung einer Entscheidung zu einer Nierentransplantation. Es gibt andere Situationen, in denen es wichtig ist, den oben genannten Test durchzuführen, aber das sind seltenere Situationen. In Israel gibt es kein Labor, das den Oxalatspiegel im Plasma testet.

Es gibt mehrere Labore, darunter das Biochemielabor am Galilee Medical Center, die einen Oxalatspiegeltest im Urin durchführen. Der Urintest wird als Erstuntersuchung bei Verdacht auf Hyperoxalurie und im Rahmen der Abklärung einer Nierensteinerkrankung durchgeführt.

In der Zeit vor dem Aufkommen der medikamentösen Behandlung von PH1, als die endgültige Behandlung auf einer Lebertransplantation basierte, war es in Israel üblich, nur Oxalat im Urin zu überwachen. In den USA und Europa war es üblich, den Plasmaoxalatspiegel nach einer Lebertransplantation zu überwachen, und wenn der Wert auf einen Wert nahe dem Normalwert abfiel, wurde empfohlen, mit einer Nierentransplantation fortzufahren. In Situationen, in denen Leber und Niere des Verstorbenen gespendet wurden, war es nicht akzeptabel, die Nierentransplantation hinauszuzögern, und es gab Zentren, die nach der Leber-Nieren-Transplantation für einen bestimmten Zeitraum eine Dialyse durchführten und gleichzeitig den Oxalatspiegel im Plasma überwachten. In Israel, as Wie bereits erwähnt, war es nicht üblich, nach einer Leber-/Leber-Nieren-Transplantation eine Dialyse durchzuführen, und es war nicht üblich, den Plasmaoxalatspiegel nach einer Transplantation zu überwachen.

Die Situation änderte sich nach der Zulassung der neuen medikamentösen Behandlung. Lumisiren wurde 2022 in Israel für alle PH1-Patienten in den Gesundheitskorb aufgenommen. Die Behandlung ersetzt die Lebertransplantation und daher besteht in folgenden Situationen die Notwendigkeit, den Oxalatspiegel im Plasma zu überwachen:

1. Zur Überwachung der Reaktion auf die Behandlung mit Lumsiren bei einem Dialysepatienten, der nicht uriniert (daher ist es nicht möglich, die Abnahme des Oxalats im Urin zu überwachen)
2. Zur Vorbereitung einer Nierentransplantation bei einem PH1-Patienten mit fortgeschrittenem Nierenversagen, der mit Lumsiran behandelt wird. Nach den neuesten Empfehlungen muss vor einer Nierentransplantation abgewartet werden, bis der Oxalatspiegel im Plasma auf einen Wert unter 70 Mikromol/Liter gesunken ist
3. Nach einer Nierentransplantation bei einem mit Lumesiren behandelten Patienten zum Zweck der Risikobewertung und der Notwendigkeit einer Dialyse nach der Transplantation, um die Niere zu schützen, wenn im Plasma hohe Oxalatspiegel vorliegen.

Das Testen von Oxalat im Plasma ist im Vergleich zum Testen des Urinspiegels nicht einfach, da die Werte im Urin um eine Größenordnung höher sind als im Plasma (in Urinwerten von mmol/Liter und in Plasma-Mikromol/Liter) und den auf dem Markt erhältlichen Tests sind bei höheren Konzentrationen empfindlicher. Darüber hinaus ist Oxalat instabil: In einer relativ basischen Umgebung (pH > 4) findet ein Übergang von Ascorbinsäure zu Oxalat statt, weshalb während der Testvorbereitungsphase eine Ansäuerung des Plasmas erforderlich ist.

Das in unserem biochemischen Labor zum Testen von Oxalat im Urin verwendete Kit basiert auf dem Enzym Oxalatoxidase und der Farbreaktion (coulometrisch) und wurde von Biotech Trinity erworben. Laut Herstellerangaben ist das Kit zur Bestimmung des Oxalatspiegels im Urin vorgesehen. Dieser Test wird in unserem Labor durchgeführt und einer internen Validierung gemäß den Anweisungen des Herstellers unterzogen.

Es gibt zwei Arten von Tests für den Oxalatspiegel im Plasma in Labors auf der Welt: Es gibt Labors, die den enzymatischen Test basierend auf dem TRINITY BIOTECH-Kit und der Spektrophotometrie verwenden, und es gibt Labors, die die Massenspektrometriemethode (Gas oder Ionen) verwenden.

Die zweite Methode (Massenspektrometrie) gilt als genau für Oxalat im Plasma, ist jedoch recht teuer und steht unserem Labor nicht zur Verfügung. Die Verwendung des Oxalatoxidase-Enzyms wird in der Forschung und für den klinischen Bedarf in führenden Labors auf der ganzen Welt akzeptiert.

Im biochemischen Labor des Universitätsklinikums CHARITE in Berlin werden Oxalattests im Plasma in großem Umfang für klinische und Forschungszwecke eingesetzt. Das Nephrologielabor und die Abteilung des CHARITE-Krankenhauses gelten als weltweit führend auf dem Gebiet der Hyperoxalurie und haben Studien veröffentlicht, in denen Plasmaoxalat mit der enzymatischen Methode im TRINITY-Kit gemessen wurde.

Angesichts der Notwendigkeit, in Israel einen Oxalatplasmatest durchzuführen, und weil Israel ein führendes Zentrum auf dem Gebiet der Hyperoxalurie ist, sind die Forscher daran interessiert, den Test im biochemischen Labor unserer Einrichtung durchzuführen. In Übereinstimmung mit den hier verfügbaren Mitteln des Labors und nach Prüfung der Effizienz und Zuverlässigkeit des enzymatischen Tests auf Basis von Oxalatoxidase beschlossen die Forscher, den Oxalatplasmatest in unserem Labor zu validieren. Da der Hersteller das Kit nur für Urintests vorsieht, ist eine Validierung anhand der Testkits des Herstellers nicht möglich und die Prüfer benötigten eine externe Validierung. In den bisher durchgeführten Pilotversuchen haben die Forscher je nach klinischem Zustand des Patienten akzeptable Werte erhalten.

Prof. Knopf von der CHARITE-Klinik in Berlin hat sich großzügig bereit erklärt, für uns eine externe Validierung des in unserem biochemischen Labor durchgeführten Plasmaoxalattests durchzuführen.

Methoden:

Anzahl der Proben: Insgesamt werden 30 Blutproben von 30 verschiedenen Patienten entnommen. Die Proben werden von verschiedenen Patienten entnommen, um ein breites Spektrum an Plasmaoxalatspiegeln zu ermitteln. Es werden etwa 10 Proben von gesunden Freiwilligen, etwa 10 Proben von Dialysepatienten ohne Hyperoxalurie-Hintergrund, etwa 5 Proben von Hyperoxalurie-Patienten unter medikamentöser Behandlung oder nach einer Lebertransplantation und etwa 5 Proben von Patienten mit fortgeschrittenem Nierenversagen, die keine Dialyse erhalten, entnommen.

Das Testprotokoll - im Anhang beigefügt. Das Protokoll ist mit dem Labor kompatibel, in dem die externe Validierung durchgeführt wird.

Jede Probe wird sofort sterilisiert und das Plasma wird in zwei Reagenzgläser aufgeteilt und gefroren aufbewahrt (-80). Ein Reagenzglas wird zur Prüfung ins Labor nach Berlin geschickt und ein Reagenzglas bleibt hier und wird in unserem Labor getestet.

Der Schritt der Behandlung der Probe bis zum Einfrieren ist derselbe, der hier durchgeführt wird.

Der Probenhandhabungsprozess im Labor wird hier von einem Labormitarbeiter durchgeführt.

Die Proben werden gefroren an das Labor in Berlin geschickt. Der zweite Schritt – die Behandlung der Probe nach dem Auftauen – erfolgt nach einem zwischen den beiden Laboren vereinbarten Protokoll, um Unterschiede in der Behandlung der Probe zu vermeiden. Außerdem werden die Forscher die Testtage zwischen den beiden Laboren koordinieren, um Unterschiede aufgrund der Aufbewahrungszeit der Proben im Gefrierschrank zu vermeiden.

Das Protokoll wurde von uns gemeinsam mit dem Labor in Berlin verfasst. Der Versand der Proben wird von Medison Pharmaceuticals im Rahmen seiner Unterstützung des Projekts zur Sensibilisierung und Verbesserung des Service für Hyperoxalurie-Patienten in Galiläa finanziert.

Statistik – nach Erhalt der Testantworten aus Berlin vergleichen die Ermittler die dort und hier erzielten Ergebnisse anhand folgender Tests:

Quantitative Daten werden anhand von Mittelwerten und Standardabweichungen, Median, Interquartilbereich (IQR) und Bereich beschrieben.

Vergleichstests für gepaarte Stichproben – zur Untersuchung der Unterschiede zwischen zwei gepaarten Stichproben mithilfe des gepaarten Stichproben-T-Tests (wenn die Unterschiede normalverteilt sind) oder des Wilcoxon-Signed-Rank-Tests, wenn die Verteilung der Unterschiede nicht normal ist. Für die Differenz zwischen den gepaarten Stichproben wird ein 95 %-Konfidenzintervall berechnet.

Korrelationstests – um die Beziehung zwischen den gepaarten Stichproben zu testen. Korrelationskoeffiziententest nach Pearson oder alternativ Korrelationskoeffiziententest nach Spearman (wird entsprechend der Größe der Stichprobe und der Form der Verteilung ausgewählt). Bland-Altman-Diagramme und Streudiagrammkurven wurden verwendet, um den Unterschied zwischen den Ergebnissen zu veranschaulichen.

Ein P-Wert von weniger als 5 % wird als statistisch signifikant angesehen.

Wahrung der Anonymität: Die Proben werden mit einem hier angegebenen Code gekennzeichnet, ohne dass Angaben zu den Formularen oder den Reagenzgläsern gemacht werden. Die Kodiertabelle wird separat auf dem Computer des Hauptforschers und in einem separaten Ordner im Schrank des Forschungskoordinators aufbewahrt.

Einverständniserklärung: Die Freiwilligen unterzeichnen nach einer Erläuterung der Bedeutung des Tests eine Einverständniserklärung.