Validációs teszt a plazma oxalát szintjére a Galilee Medical Center biokémiai laboratóriumában

Az oxalát forrása a szervezetben a máj endogén termelése és a táplálkozás. Az oxalát a vizelettel ürül a veséken keresztül. Olyan helyzetekben, amikor a vizeletben feleslegben van oxalát, az a kalciummal együtt kristályosodhat, és kalcium-oxalát kristályokként ülepedhet a vesében, és vesekárosodást okozhat. Előrehaladott vesekárosodás esetén az oxalát szekréciója a vizeletben károsodik, és az oxalát felhalmozódik a vérben, és lerakódik a test összes szövetében, beleértve a szemet, a csontokat, a csontvelőt, az ereket és egyebeket. Azokat az állapotokat, amelyekben a szervezetben magas az oxalátszint, mérgezés (etilénglikol) vagy másodlagos hiperoxaluria okozta állapotok, például cisztás fibrózis vagy gyulladásos bélbetegségek (zsíros hasmenés esetén fokozott az oxalát felszívódása a bélben) ) vagy primer hyperoxaluria esetén.

Az elsődleges hiperoxaluria olyan betegségek csoportja, amelyeket az oxalát máj általi megnövekedett kiválasztódása okoz, a májban az oxalát metabolizmusának genetikai hibája miatt. Az 1-es típusú hyperoxaluria (PH1) a legsúlyosabb az egész csoportban, és a legtöbb betegnél az élet második évtizedére veseelégtelenséget okoz. A PH1 kezelése egészen a közelmúltig májátültetésen alapult a normál enzimszint helyreállítása érdekében, és a legtöbb esetben veseátültetésre is szükség volt. 2021 novemberében az FDA jóváhagyta a hiperoxaluria elleni áttörést jelentő gyógyszert, a LUMASIRAN-t.

A Galileai Orvosi Központ Gyermeknephrológiai Osztálya a hyperoxaluria szakterülete. A betegség előfordulása a lakosság körében Galileában az egyik legmagasabb a világon, és ennek eredményeként sok tapasztalat halmozódott fel a betegség kezelésében központunkban.

A gyermeknefrológiai osztályt az ALNYLAM cég klinikai kutatásainak központjaként használták a LUMASIRAN gyógyszer hatékonyságának és biztonságosságának tesztelésére. Jelenleg nyolc PH1-es beteg kapja az új gyógyszert (kutatással vagy egészségkosáron keresztül), akiket intézetünk gyermeknefrológiai osztályán monitoroznak.

A plazma oxalátszintjének vizsgálata főként hyperoxaluria betegek esetén szükséges, főként a kezelésre adott válasz monitorozása vagy a veseátültetési döntés előkészítése céljából. Vannak más helyzetek is, amelyekben fontos a fent említett teszt elvégzése, de ezek ritkább helyzetek. Izraelben nincs olyan laboratórium, amely a plazma oxalát szintjét vizsgálná.

Számos laboratórium van, köztük a Galileai Egészségügyi Központ biokémiai laboratóriuma, amely oxalátszint-vizsgálatot végez a vizeletben. A vizeletvizsgálatot kezdeti felmérésként végzik olyan helyzetekben, amikor hyperoxaluria gyanúja merül fel, valamint a vesekőbetegség vizsgálatának részeként.

A PH1 gyógyszeres kezelésének megjelenése előtti időszakban, amikor a végleges kezelés májátültetésen alapult, Izraelben szokásos volt a vizeletben csak az oxalát ellenőrzése. Az USA-ban és Európában a májátültetés után szokás volt a plazma oxalátszintjének monitorozása, és amikor a szint a normálishoz közeli értékre csökkent, veseátültetést javasoltak folytatni. Azokban a helyzetekben, amikor az elhunyttól májat és vesét adományoztak, nem volt elfogadható a veseátültetés késleltetése, és voltak olyan központok, amelyek a máj-vesetranszplantáció után egy bizonyos ideig dialízist végeztek, miközben ellenőrizték a plazma oxalátszintjét Izraelben, pl. említettük, hogy a máj/máj-vese transzplantáció után nem volt szokás dialízist végezni, és a transzplantáció után nem volt szokás a plazma oxalátszintjét monitorozni.

A helyzet az új gyógyszeres kezelés jóváhagyását követően változott. A Lumisiren 2022-ben minden PH1-es beteg számára bekerült az egészségügyi kosárba Izraelben. A kezelés helyettesíti a májátültetést, és ennek eredményeként a plazma oxalátszintjének monitorozása szükséges a következő helyzetekben:

1. A lumsiren-kezelésre adott válasz monitorozása olyan dializált betegnél, aki nem vizelet (ezért nem lehet nyomon követni a vizelet oxalátszintjének csökkenését)
2. Veseátültetés előkészítése egy előrehaladott veseelégtelenségben szenvedő PH1-es betegnél, akit lumsiránnal kezelnek. A legújabb ajánlások szerint a veseátültetés előtt meg kell várni, hogy a plazma oxaláttartalma 70 mikromol/liter alá csökkenjen.
3. Lumesirennel kezelt beteg veseátültetése után a kockázatértékelés és a transzplantáció utáni dialízis szükségessége érdekében a vese védelme érdekében, ha a plazmában magas az oxalát szint.

Az oxalát vizsgálata a plazmában nem egyszerű a vizeletben mért szinthez képest, mivel a vizeletben mért értékek egy nagyságrenddel magasabbak, mint a plazmában (mol/liter vizeletben és plazma mikromol/literben), és a piacon elérhető tesztek érzékenyebbek nagyobb koncentrációban. Ezenkívül az oxalát instabil: viszonylag bázikus környezetben (4pH>) az aszkorbinsav oxaláttá alakul, ezért a plazma savanyítása szükséges a teszt előkészítési szakaszában.

A biokémiai laboratóriumunkban a vizeletben lévő oxalát tesztelésére használt készlet az oxalát-oxidáz enzimen és a színreakción (coulometriás) alapul, és a Biotech Trinitytől vásároltuk. A gyártó utasításai szerint a készlet a vizelet oxalátszintjének vizsgálatára szolgál. Ezt a tesztet laboratóriumunkban végezzük, és a gyártó utasításai szerint belső validáláson esett át.

A plazma oxalátszintjének meghatározására kétféle vizsgálat létezik a világ laboratóriumaiban - Vannak olyan laboratóriumok, amelyek a TRINITY BIOTECH készleten és spektrofotometrián alapuló enzimes tesztet alkalmazzák, és vannak olyan laboratóriumok, amelyek tömegspektrometriás módszert (gáz vagy ion) alkalmaznak.

A második módszer (tömegspektrometria) pontosnak tekinthető a plazmában lévő oxalát esetében, de meglehetősen drága, és laboratóriumunk számára nem elérhető. Az oxalát-oxidáz enzim alkalmazása elfogadott a kutatásban és a klinikai igények kielégítésében a világ vezető laboratóriumaiban.

A berlini CHARITE Egyetemi Kórház biokémiai laboratóriumában széles körben alkalmazzák a plazmában végzett oxalátteszteket klinikai és kutatási célokra. A CHARITE Kórház Nephrológiai Laboratóriuma és Osztálya a világ vezető szerepének számít a hiperoxaluria területén, és olyan tanulmányokat tettek közzé, amelyekben a plazma oxalátot a TRINITY kitben található enzimes módszerrel mérték.

Tekintettel arra, hogy Izraelben oxalát plazmatesztet kell végezni, és Izraelben a hiperoxaluria területén vezető központ lévén, a kutatók érdeklik, hogy a tesztet intézményünk biokémiai laboratóriumában helyezzék el. Az itteni laboratórium rendelkezésére álló eszközökkel összhangban, valamint az oxalát-oxidáz alapú enzimes teszt hatékonyságának és megbízhatóságának vizsgálata után a kutatók úgy döntöttek, hogy laboratóriumunkban validálják az oxalát plazmatesztet. Mivel a gyártó a készletet csak vizeletvizsgálatra jelöli ki, a gyártó tesztkészletei alapján nem lehetséges az érvényesítés, és a vizsgálóknak külső validációra volt szükségük. Az eddig lefolytatott kísérleti vizsgálatok során a vizsgálók a páciens klinikai állapotának megfelelően elfogadható értékeket kaptak.

Prof. Knopf a berlini CHARITE Kórházból nagylelkűen beleegyezett abba, hogy külső validálást végezzen számunkra a biokémiai laboratóriumunkban elvégzett plazma-oxalát teszthez.

Mód:

Minták száma: összesen 30 vérmintát vesznek, 30 különböző betegtől. A mintákat számos betegtől veszik a plazma oxalátszintjének széles skálájának elérése érdekében. Körülbelül 10 mintát veszünk egészséges önkéntesektől, körülbelül 10 mintát a hiperoxaluria hátterű dialízissel kezelt betegektől, körülbelül 5 mintát gyógyszeres kezelésben részesülő vagy májátültetés utáni hiperoxaluriás betegektől, és körülbelül 5 mintát előrehaladott veseelégtelenségben nem részesülő betegektől.

A vizsgálati jegyzőkönyv - mellékletben csatolva. A protokoll kompatibilis azzal a laboratóriummal, ahol a külső validálást végzik.

Minden mintát azonnal sterilizálnak, a plazmát két kémcsőbe osztják, és lefagyasztják (-80 °C). Egy kémcsövet küldenek tesztelésre a berlini laboratóriumba, egy kémcső pedig itt marad, és a mi laboratóriumunkban tesztelik.

A minta fagyasztásig történő kezelésének lépése ugyanaz, mint itt.

A mintakezelési folyamatot az itteni laboratóriumban egy laboratóriumi alkalmazott végzi.

A mintákat fagyasztva küldik a berlini laboratóriumba. A második lépés - a minta felolvasztás utáni kezelése - a két laboratórium között egyeztetett protokoll szerint történik, a mintakezelési különbségek elkerülése érdekében. A vizsgálók a vizsgálatok napjait is egyeztetik a két laboratórium között, hogy elkerüljék a minták fagyasztóban való tárolási idejéből adódó eltéréseket.

A jegyzőkönyvet a berlini laboratóriummal közösen írtuk. A minták szállítását a Medison Pharmaceuticals finanszírozza a galileai hyperoxaluria betegek figyelemfelkeltésére és a szolgáltatások javítására irányuló projekt támogatásának részeként.

Statisztikák – a berlini tesztválaszok kézhezvétele után a kutatók az alábbi tesztekkel hasonlítják össze az ott és itt kapott eredményeket:

A mennyiségi adatokat átlagok és szórások, medián, interkvartilis tartomány (IQR) és tartomány segítségével írjuk le.

Összehasonlító tesztek páros mintákhoz - két párosított minta közötti különbségek vizsgálata a páros minta T teszttel (ha a különbségek normális eloszlásúak) vagy a Wilcoxon előjeles rangpróbával, ha a különbségek eloszlása ​​nem normális. A párosított minták közötti különbségre 95%-os konfidencia intervallumot számítanak ki.

Korrelációs tesztek - a párosított minták közötti kapcsolat tesztelésére. A Pearson-féle korrelációs koefficiens teszt vagy a Spearman-féle korrelációs koefficiens teszt (a minta mérete és az eloszlás alakja szerint kerül kiválasztásra) Bland-Altman és Scatter plot görbéket használtunk az eredmények közötti különbség bemutatására.

Az 5%-nál alacsonyabb P-érték statisztikailag szignifikánsnak minősül.

Az anonimitás megőrzése: a mintákat az itt megadott kóddal jelöljük meg anélkül, hogy a nyomtatványokon vagy a kémcsöveken azonosítanánk azokat. A kódoló táblázat külön-külön a vezető kutató számítógépén és a kutatási koordinátor szekrényében egy külön iratgyűjtőben kerül tárolásra.

Tájékozott beleegyezés: Az önkéntesek aláírnak egy tájékozott beleegyezési űrlapot, miután elmagyarázták a teszt jelentését.