Plasman oksalaattitason validointitesti Galilean lääketieteellisen keskuksen biokemiallisessa laboratoriossa

Kehon oksalaattilähde on endogeeninen tuotanto maksassa ja ravitsemus. Oksalaatti erittyy virtsaan munuaisten kautta. Tilanteissa, joissa virtsassa on liikaa oksalaattia, se voi kiteytyä yhdessä kalsiumin kanssa ja laskeutua kalsiumoksalaattikiteiksi munuaiseen ja aiheuttaa munuaisvaurioita. Jos munuaisvaurio on edennyt, oksalaattien erittyminen virtsaan on heikentynyt, ja oksalaatti kerääntyy vereen ja kerääntyy kaikkiin kehon kudoksiin, mukaan lukien silmät, luut, luuytime, verisuonet ja monet muut. Tilat, joissa elimistössä on korkea oksalaattipitoisuus, johtuvat myrkytyksestä (etyleeniglykoli) tai sekundaarisesta hyperoksaluriasta, kuten kystisessä fibroosissa tai tulehduksellisissa suolistosairaudissa (oksalaatin imeytyminen suolistosta lisääntyy rasvaripulitapauksissa ) tai primaarisessa hyperoksaluriassa.

Primaarinen hyperoksaluria on ryhmä sairauksia, jotka johtuvat maksan lisääntyneestä oksalaatin erittymisestä maksan oksalaattiaineenvaihduntareitin geneettisestä viasta. Hyperoksaluria tyyppi 1 (PH1) on vakavin koko ryhmästä ja aiheuttaa munuaisten vajaatoimintaa useimmille potilaille toisella elinvuosikymmenellä. PH1:n hoito perustui viime aikoihin asti maksansiirtoon normaalin entsyymin palauttamiseksi, ja useimmissa tapauksissa vaadittiin myös munuaisensiirto. Marraskuussa 2021 FDA hyväksyi läpimurtolääkkeen hyperoksaluriaan, LUMASIRANIN.

Galilean lääketieteellisen keskuksen lasten nefrologian yksikkö on hyperoksaluriaan erikoistunut keskus. Taudin esiintyvyys väestön keskuudessa Galileassa on yksi maailman korkeimmista ja sen seurauksena on kertynyt paljon kokemusta taudin hoidosta keskustassamme.

Lasten nefrologiayksikköä käytettiin myös ALNYLAM-yhtiön kliinisen tutkimuksen keskuksena LUMASIRAN-lääkkeen tehon ja turvallisuuden testaamiseksi. Uutta lääkettä (tutkimuksen tai terveyskorin kautta) saa nyt kahdeksan PH1-potilasta, jotka ovat seurannassa laitoksemme lastennefrologian yksikössä.

Plasman oksalaattipitoisuuden testaamista tarvitaan pääasiassa hyperoksaluriapotilailla, lähinnä hoitovasteen seurantaa tai munuaisensiirtopäätöstä varten. On myös muita tilanteita, joissa on tärkeää suorittaa testi yllä mainitulla tavalla, mutta nämä ovat harvinaisempia tilanteita. Israelissa ei ole laboratoriota, joka testaa oksalaattipitoisuutta plasmassa.

On olemassa useita laboratorioita, muun muassa Galilean lääketieteellisen keskuksen biokemian laboratorio, jotka suorittavat virtsan oksalaattipitoisuuden. Virtsakoe tehdään alkututkimuksena tilanteissa, joissa epäillään hyperoksaluriaa ja osana munuaiskivisairauden tutkimusta.

Aikana ennen PH1-lääkehoidon ilmestymistä, jolloin lopullinen hoito perustui maksansiirtoon, Israelissa oli tapana seurata vain oksalaattia virtsasta. Yhdysvalloissa ja Euroopassa oli tapana seurata plasman oksalaattipitoisuutta maksansiirron jälkeen, ja kun taso putosi lähelle normaalia, suositeltiin munuaisensiirtoa. Tilanteissa, joissa vainajalta luovutettiin maksa ja munuainen, munuaisensiirtoa ei ollut hyväksyttävää viivyttää, ja oli keskuksia, jotka suorittivat dialyysihoitoa tietyn ajan maksa-munuaisensiirron jälkeen samalla kun seurasivat plasman oksalaattitasoja Israelissa mm. mainittiin, ei ollut tapana suorittaa dialyysiä maksa-/maksa-munuaissiirron jälkeen, eikä ollut tapana seurata plasman oksalaattitasoja siirron jälkeen.

Tilanne muuttui uuden lääkehoidon hyväksymisen jälkeen. Lumisiren pääsi Israelin terveyskoriin vuonna 2022 kaikille PH1-potilaille. Hoito korvaa maksansiirron ja sen seurauksena plasman oksalaattipitoisuuksia on seurattava seuraavissa tilanteissa:

1. Lumsireenihoidon vasteen seuranta dialyysipotilaalla, joka ei virtsaa (siksi virtsan oksalaattipitoisuuden vähenemistä ei ole mahdollista seurata)
2. Valmistellaan munuaisensiirtoa PH1-potilaalle, jolla on pitkälle edennyt munuaisten vajaatoiminta ja jota hoidetaan lumsiraanilla. Viimeisimpien suositusten mukaan ennen munuaisensiirtoa on odotettava oksalaattipitoisuuden laskua plasmassa alle 70 mikromoolia/litra
3. Lumesireenilla hoidetun potilaan munuaisensiirron jälkeen riskinarviointia ja dialyysin tarvetta varten siirron jälkeen munuaisen suojelemiseksi, jos plasmassa on korkeita oksalaattipitoisuuksia.

Oksalaatin testaus plasmassa ei ole yksinkertaista verrattuna virtsan pitoisuuden mittaamiseen, koska virtsan arvot ovat suuruusluokkaa korkeammat kuin plasmassa (virtsan arvoina mmol/litra ja plasman mikromol/litra) ja markkinoilla olevat testit ovat herkempiä suuremmilla pitoisuuksilla. Lisäksi oksalaatti on epästabiili: askorbiinihappo muuttuu oksalaattiksi suhteellisen emäksisessä ympäristössä (4pH>) ja siksi plasman happamoittamista tarvitaan testin valmisteluvaiheessa.

Biokemiallisessa laboratoriossamme virtsan oksalaattitestaukseen käytetty sarja perustuu oksalaattioksidaasientsyymiin ja värireaktioon (kolometrinen), ja se ostettiin Biotech Trinityltä. Valmistajan ohjeiden mukaan sarja on tarkoitettu virtsan oksalaattipitoisuuden mittaamiseen. Tämä testi suoritetaan laboratoriossamme ja sille on tehty sisäinen validointi valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Maailman laboratorioissa on kahdenlaisia ​​testejä plasman oksalaattitasolle - On laboratorioita, jotka käyttävät TRINITY BIOTECH -kittiin ja spektrofotometriaan perustuvaa entsymaattista testiä, ja on laboratorioita, jotka käyttävät massaspektrometriamenetelmää (kaasu tai ionit).

Toista menetelmää (massaspektrometriaa) pidetään tarkana plasmassa olevalle oksalaattille, mutta se on melko kallis eikä laboratoriomme käytettävissä. Oksalaattioksidaasientsyymin käyttö on hyväksytty tutkimuksessa ja kliinisiin tarpeisiin maailman johtavissa laboratorioissa.

Berliinin CHARITE-yliopistosairaalan biokemiallisessa laboratoriossa käytetään laajasti plasman oksalaattitestejä kliinisiin ja tutkimustarkoituksiin. CHARITE-sairaalan nefrologialaboratoriota ja osastoa pidetään maailman johtajina hyperoksaluria-alalla, ja ne julkaisivat tutkimuksia, joissa plasman oksalaattia mitattiin entsymaattisella menetelmällä TRINITY-sarjassa.

Ottaen huomioon tarpeen suorittaa oksalaattiplasmatesti Israelissa ja koska olemme johtava keskus hyperoksaluria-alalla Israelissa, tutkijat ovat kiinnostuneita sijoittamaan testin laitoksemme biokemialliseen laboratorioon. Tässä laboratoriossa käytettävissä olevien keinojen mukaisesti ja oksalaattioksidaasiin perustuvan entsymaattisen testin tehokkuuden ja luotettavuuden testattuaan tutkijat päättivät validoida oksalaattiplasmatestin laboratoriossamme. Koska valmistaja määrittelee sarjan vain virtsan testausta varten, ei ole mahdollista suorittaa validointia valmistajan testisarjojen perusteella ja tutkijat tarvitsivat ulkoista validointia. Tähän mennessä suoritetuissa pilottikokeissa tutkijat ovat saaneet hyväksyttäviä arvoja potilaan kliinisen tilan mukaan.

Professori Knopf CHARITE-sairaalasta Berliinistä suostui anteliaasti suorittamaan meille ulkoisen validoinnin biokemiallisessa laboratoriossamme tehdylle plasmaoksalaattitestille.

Menetelmät:

Näytteiden määrä: yhteensä 30 verinäytettä otetaan 30 eri potilaalta. Näytteet otetaan useilta potilailta, jotta saadaan laaja valikoima plasman oksalaattitasoja. Noin 10 näytettä otetaan terveiltä vapaaehtoisilta, noin 10 näytettä dialyysipotilailta, joilla ei ole hyperoksaluriataustaa, noin 5 näytettä hyperoksaluriapotilailta, jotka saavat lääkehoitoa tai maksansiirron jälkeen, ja noin 5 näytettä edenneeltä munuaisten vajaatoimintapotilailta, jotka eivät ole dialyysihoidossa.

Testipöytäkirja - liitteenä. Protokolla on yhteensopiva sen laboratorion kanssa, jossa ulkoinen validointi suoritetaan.

Jokainen näyte steriloidaan välittömästi ja plasma jaetaan kahteen koeputkeen ja pidetään pakastettuna (-80). Yksi koeputki lähetetään testattavaksi Berliinin laboratorioon ja yksi koeputki jää tänne testattavaksi laboratoriossamme.

Vaihe, jossa näyte käsitellään pakastukseen asti, on sama kuin tässä.

Näytteenkäsittelyprosessin tässä laboratoriossa suorittaa yksi laboratorion työntekijä.

Näytteet lähetetään pakastettuna Berliinin laboratorioon. Toinen vaihe - näytteen käsittely sulatuksen jälkeen - suoritetaan kahden laboratorion välisen sovitun protokollan mukaisesti, jotta vältetään näytteen käsittelyerot. Lisäksi tutkijat koordinoivat kahden laboratorion väliset testipäivät, jotta vältytään näytteiden säilytysajasta pakastimessa syntyvältä erolta.

Protokollan teimme yhdessä Berliinin laboratorion kanssa. Näytteiden toimituksen rahoittaa Medison Pharmaceuticals osana tukeaan hankkeelle, jolla lisätään tietoisuutta ja parannetaan hyperoksaluriapotilaiden palvelua Galileassa.

Tilastot - saatuaan testivastaukset Berliinistä tutkijat vertaavat siellä ja täällä saatuja tuloksia seuraavilla testeillä:

Kvantitatiiviset tiedot kuvataan käyttämällä keskiarvoja ja keskihajontoja, mediaania, kvartiiliväliä (IQR) ja vaihteluväliä.

Parinäytteiden vertailutestit - kahden parillisen näytteen välisten erojen tutkiminen käyttämällä parinäytteen T-testiä (jos erot ovat normaalijakautuneita) tai Wilcoxonin etumerkillistä järjestystestiä, jos erojen jakautuminen ei ole normaali. Parillisten näytteiden väliselle erolle lasketaan 95 %:n luottamusväli.

Korrelaatiotestit - testaamaan parillisten näytteiden välistä suhdetta. Tulosten välisen eron havainnollistamiseen käytettiin Pearsonin korrelaatiokerrointestiä tai vaihtoehtoisesti Spearmanin korrelaatiokerrointestiä (valitaan näytteen koon ja jakauman muodon mukaan) Bland-Altman- ja Scatter-diagrammikäyriä.

P-arvoa alle 5 % pidetään tilastollisesti merkitsevänä.

Anonymiteetin säilyttäminen: näytteet merkitään tässä annetulla koodilla ilman, että lomakkeissa tai koeputkissa ole tunnistetietoja. Koodaustaulukkoa säilytetään erikseen päätutkijan tietokoneella ja erillisessä kansiossa tutkimuskoordinaattorin kaapissa.

Tietoinen suostumus: Vapaaehtoiset allekirjoittavat tietoisen suostumuslomakkeen selvitettyään testin merkityksen.