Validatietest voor plasma-oxalaatniveau in een biochemisch laboratorium in het Galilea Medical Center

De bron van oxalaat in het lichaam is de endogene productie in de lever en voeding. Het oxalaat wordt door de nieren in de urine uitgescheiden. In situaties waarin er teveel oxalaat in de urine zit, kan het samen met calcium kristalliseren en zich als calciumoxalaatkristallen in de nieren nestelen en nierbeschadiging veroorzaken. Als er sprake is van vergevorderde nierbeschadiging, is de uitscheiding van oxalaat in de urine verstoord en hoopt het oxalaat zich op in het bloed en zet het zich af in alle weefsels van het lichaam, inclusief ogen, botten, beenmerg, bloedvaten en meer. Aandoeningen waarbij er een hoog oxalaatgehalte in het lichaam aanwezig is, worden veroorzaakt door vergiftiging (ethyleenglycol) of aandoeningen van secundaire hyperoxalurie zoals bij cystische fibrose of inflammatoire darmziekten (er is een verhoogde opname van oxalaat in de darm in geval van vette diarree ) of bij primaire hyperoxalurie.

Primaire hyperoxalurie is een groep ziekten die wordt veroorzaakt door een verhoogde uitscheiding van oxalaat door de lever, als gevolg van een genetisch defect in de oxalaatmetabolismeroute in de lever. Hyperoxalurie type 1 (PH1) is de ernstigste van de hele groep en veroorzaakt bij de meeste patiënten nierfalen in het tweede decennium van hun leven. De behandeling van PH1 was tot voor kort gebaseerd op een levertransplantatie om een ​​normaal enzym te herstellen en in de meeste gevallen was ook een niertransplantatie nodig. In november 2021 keurde de FDA een baanbrekend medicijn tegen hyperoxalurie goed, LUMASIRAN.

De Pediatrische Nefrologie-eenheid van het Galilee Medical Center is een gespecialiseerd centrum voor hyperoxalurie. De incidentie van de ziekte onder de bevolking in Galilea is een van de hoogste ter wereld en als gevolg daarvan is er veel ervaring opgedaan met de behandeling van de ziekte in ons centrum.

Ook werd de pediatrische nefrologie-eenheid gebruikt als centrum voor het klinische onderzoek van het bedrijf ALNYLAM om de werkzaamheid en veiligheid van het medicijn LUMASIRAN te testen. Er zijn nu acht PH1-patiënten die het nieuwe medicijn krijgen (via onderzoek of via de gezondheidszorgmand) en die worden gevolgd op de pediatrische nefrologie-eenheid van onze instelling.

Het testen van de oxalaatspiegel in het plasma is vooral nodig bij patiënten met hyperoxalurie, voornamelijk met het oog op het monitoren van de respons op de behandeling of ter voorbereiding op een beslissing over een niertransplantatie. Er zijn nog andere situaties waarin het belangrijk is om de test uit te voeren zoals hierboven vermeld, maar dit zijn zeldzamere situaties. In Israël is er geen laboratorium dat het oxalaatgehalte in plasma test.

Er zijn verschillende laboratoria, waaronder het biochemielaboratorium van het Galilee Medical Center, die een test op het oxalaatniveau in de urine uitvoeren. De urinetest wordt uitgevoerd als een eerste onderzoek in situaties waarin hyperoxalurie wordt vermoed en als onderdeel van het onderzoek naar niersteenziekte.

In de periode vóór het verschijnen van de medicamenteuze behandeling voor PH1, toen de definitieve behandeling gebaseerd was op een levertransplantatie, was het in Israël gebruikelijk om alleen oxalaat in de urine te monitoren. In de VS en Europa was het gebruikelijk om de plasma-oxalaatspiegels te controleren na een levertransplantatie, en wanneer de spiegel daalde tot een waarde die dicht bij de normale waarde lag, werd aanbevolen om over te gaan tot een niertransplantatie. In situaties waarin een lever en een nier van de overledene werden gedoneerd, was het niet acceptabel om de niertransplantatie uit te stellen, en er waren centra die na de lever-niertransplantatie gedurende een bepaalde periode dialyse uitvoerden terwijl ze de plasma-oxalaatspiegels in de gaten hielden. Zoals gezegd was het niet gebruikelijk om dialyse uit te voeren na een lever-niertransplantatie en was het niet gebruikelijk om de plasma-oxalaatspiegels na de transplantatie te controleren.

De situatie veranderde na de goedkeuring van de nieuwe medicamenteuze behandeling. Lumisiren werd in 2022 opgenomen in de gezondheidszorgmand in Israël voor alle PH1-patiënten. De behandeling vervangt de levertransplantatie en als gevolg daarvan is het nodig om de oxalaatspiegels in het plasma te controleren in de volgende situaties:

1. Om de respons op behandeling met lumsiren te monitoren bij een dialysepatiënt die niet plast (daarom is het niet mogelijk om de afname van oxalaat in de urine te controleren)
2. Ter voorbereiding op een niertransplantatie bij een PH1-patiënt met gevorderd nierfalen die wordt behandeld met lumsiran. Volgens de laatste aanbevelingen moet vóór een niertransplantatie worden gewacht tot de oxalaatdaling in het plasma is gedaald tot een waarde lager dan 70 micromol/liter.
3. Na een niertransplantatie bij een patiënt die met lumesiren wordt behandeld, met het oog op risicobeoordeling en de noodzaak van dialyse na de transplantatie om de nier te beschermen als er hoge concentraties oxalaat in het plasma aanwezig zijn.

Het testen van oxalaat in plasma is niet eenvoudig vergeleken met het testen van de concentratie in urine, omdat de waarden in urine een orde van grootte hoger zijn dan in plasma (in urine waarden van mmol/liter en in plasma micromol/liter) en de tests die op de markt verkrijgbaar zijn. zijn gevoeliger bij hogere concentraties. Bovendien is oxalaat instabiel: er vindt een overgang plaats van ascorbinezuur naar oxalaat in een relatief basisch milieu (4pH>) en daarom is verzuring van het plasma vereist tijdens de testvoorbereidingsfase.

De kit die wordt gebruikt om oxalaat in de urine in ons biochemisch laboratorium te testen, is gebaseerd op het enzym oxalaatoxidase en kleurreactie (coulometrisch) en is gekocht bij Biotech Trinity. Volgens de instructies van de fabrikant is de kit bedoeld voor het testen van het oxalaatgehalte in de urine. Deze test wordt uitgevoerd in ons laboratorium en heeft een interne validatie ondergaan volgens de instructies van de fabrikant.

Er zijn twee soorten tests voor het oxalaatgehalte in plasma in laboratoria in de wereld. Er zijn laboratoria die de enzymatische test gebruiken op basis van de TRINITY BIOTECH-kit en spectrofotometrie, en er zijn laboratoria die de massaspectrometriemethode gebruiken (gas of ionen).

De tweede methode (massaspectrometrie) wordt als nauwkeurig beschouwd voor oxalaat in plasma, maar is vrij duur en niet beschikbaar voor ons laboratorium. Het gebruik van het oxalaatoxidase-enzym wordt geaccepteerd in onderzoek en voor klinische behoeften in toonaangevende laboratoria in de wereld.

In het biochemische laboratorium van het CHARITE Universitair Ziekenhuis in Berlijn wordt uitgebreid gebruik gemaakt van oxalaattesten in plasma voor klinische en onderzoeksdoeleinden. Het nefrologielaboratorium en de afdeling van het CHARITE-ziekenhuis worden beschouwd als wereldleiders op het gebied van hyperoxalurie en publiceerden onderzoeken waarin plasma-oxalaat werd gemeten met de enzymatische methode in de TRINITY-kit.

Gezien de noodzaak om een ​​oxalaatplasmatest uit te voeren in Israël, en omdat we een toonaangevend centrum zijn op het gebied van hyperoxalurie in Israël, zijn de onderzoekers geïnteresseerd om de test in het biochemische laboratorium van onze instelling te plaatsen. In overeenstemming met de middelen waarover het laboratorium hier beschikt en na het testen van de efficiëntie en betrouwbaarheid van de enzymatische test op basis van oxalaatoxidase, besloten de onderzoekers de oxalaatplasmatest in ons laboratorium te valideren. Omdat de fabrikant de kit alleen voor urinetests aanwijst, is het niet mogelijk om validatie uit te voeren op basis van de testkits van de fabrikant en hadden de onderzoekers externe validatie nodig. Bij de pilottests die tot nu toe zijn uitgevoerd, hebben de onderzoekers aanvaardbare waarden verkregen, afhankelijk van de klinische toestand van de patiënt.

Prof. Knopf van het CHARITE-ziekenhuis in Berlijn was bereid om voor ons een externe validatie uit te voeren voor de plasma-oxalaattest die in ons biochemisch laboratorium werd uitgevoerd.

Methoden:

Aantal monsters: Er worden in totaal 30 bloedmonsters genomen, bij 30 verschillende patiënten. De monsters zullen worden genomen bij een verscheidenheid aan patiënten om een ​​breed scala aan plasma-oxalaatniveaus te verkrijgen. Er zullen ongeveer 10 monsters worden genomen van gezonde vrijwilligers, ongeveer 10 monsters van dialysepatiënten zonder een achtergrond van hyperoxalurie, ongeveer 5 monsters van patiënten met hyperoxalurie die een medicamenteuze behandeling krijgen of na een levertransplantatie, en ongeveer 5 monsters van patiënten met gevorderd nierfalen die geen dialyse ondergaan.

Het testprotocol - bijgevoegd in de bijlage. Het protocol is compatibel met het laboratorium waar de externe validatie zal worden uitgevoerd.

Elk monster wordt onmiddellijk gesteriliseerd en het plasma wordt in twee reageerbuizen verdeeld en bevroren gehouden (-80). Eén reageerbuisje wordt naar het laboratorium in Berlijn gestuurd om te worden getest en één reageerbuisje blijft hier en wordt in ons laboratorium getest.

De stap van het behandelen van het monster tot het invriezen is dezelfde als die hier zal worden uitgevoerd.

Het monsterbehandelingsproces in het laboratorium wordt hier uitgevoerd door één laboratoriummedewerker.

De monsters worden bevroren naar het laboratorium in Berlijn gestuurd. De tweede stap – behandeling van het monster na ontdooien – zal worden uitgevoerd volgens een overeengekomen protocol tussen de twee laboratoria, om verschillen in de behandeling van het monster te voorkomen. Ook zullen de onderzoekers de testdagen tussen de twee laboratoria coördineren om te voorkomen dat er een verschil ontstaat als gevolg van de bewaartijd van de monsters in de vriezer.

Het protocol is door ons samen met het laboratorium in Berlijn geschreven. De verzending van de monsters zal worden gefinancierd door Medison Pharmaceuticals als onderdeel van haar steun aan het project om het bewustzijn te vergroten en de service voor hyperoxaluriepatiënten in Galilea te verbeteren.

Statistieken - na ontvangst van de testantwoorden uit Berlijn vergelijken de onderzoekers de daar en hier verkregen resultaten met behulp van de volgende tests:

Kwantitatieve gegevens zullen worden beschreven met behulp van gemiddelden en standaarddeviaties, mediaan, interkwartielbereik (IQR) en bereik.

Vergelijkingstests voor gepaarde monsters - om de verschillen tussen twee gepaarde monsters te onderzoeken met behulp van de gepaarde monster T-test (als de verschillen normaal verdeeld zijn) of de Wilcoxon Signed Rank-test als de verdeling van de verschillen niet normaal is. Voor het verschil tussen de gepaarde monsters wordt een betrouwbaarheidsinterval van 95% berekend.

Correlatietests - om de relatie tussen de gepaarde monsters te testen. Pearson's correlatiecoëfficiënttest of als alternatief Spearman's correlatiecoëfficiënttest (zal worden gekozen op basis van de grootte van de steekproef en de vorm van de verdeling). Bland-Altman-plot en Scatter-plotcurven werden gebruikt om het verschil tussen de resultaten aan te tonen.

Een P-waarde lager dan 5% wordt als statistisch significant beschouwd.

Anonimiteit behouden: de monsters worden gemarkeerd met een code die hier wordt vermeld, zonder dat er details op de formulieren of de reageerbuisjes staan. De codeertabel wordt apart bewaard op de computer van de hoofdonderzoeker en in een aparte map in de kast van de onderzoekscoördinator.

Geïnformeerde toestemming: De vrijwilligers ondertekenen een geïnformeerde toestemmingsformulier na uitleg over de betekenis van de test.