Teste de validação para nível de oxalato plasmático em um laboratório bioquímico do Galilee Medical Center

A fonte de oxalato no corpo é a produção endógena no fígado e a nutrição. O oxalato é excretado na urina pelos rins. Em situações em que há excesso de oxalato na urina, este pode cristalizar juntamente com o cálcio e depositar-se como cristais de oxalato de cálcio nos rins e causar danos renais. Se houver dano renal avançado, a secreção de oxalato na urina é prejudicada e o oxalato se acumula no sangue e se deposita em todos os tecidos do corpo, incluindo olhos, ossos, medula óssea, vasos sanguíneos e muito mais. Condições em que há um alto nível de oxalato no organismo são causadas por envenenamento (etilenoglicol) ou condições de hiperoxalúria secundária, como na fibrose cística ou doenças inflamatórias intestinais (há aumento da absorção de oxalato no intestino em casos de diarreia gordurosa ) ou na hiperoxalúria primária.

A hiperoxalúria primária é um grupo de doenças causadas pelo aumento da excreção de oxalato pelo fígado, devido a um defeito genético na via do metabolismo do oxalato no fígado. A hiperoxalúria tipo 1 (PH1) é a mais grave de todo o grupo e causa insuficiência renal na maioria dos pacientes na segunda década de vida. O tratamento da PH1 baseava-se até recentemente num transplante de fígado para restaurar uma enzima normal e, na maioria dos casos, também era necessário um transplante de rim. Em novembro de 2021, o FDA aprovou um medicamento inovador para hiperoxalúria, LUMASIRAN.

A Unidade de Nefrologia Pediátrica do Galilee Medical Center é um centro especializado em hiperoxalúria. A incidência da doença na população da Galileia é uma das mais elevadas do mundo e como resultado foi acumulada muita experiência no tratamento da doença no nosso centro.

Além disso, a unidade de nefrologia pediátrica foi utilizada como centro de pesquisa clínica da empresa ALNYLAM para testar a eficácia e segurança do medicamento LUMASIRAN. Já são oito pacientes PH1 que recebem o novo medicamento (por meio de pesquisa ou da cesta de saúde) que estão em acompanhamento na unidade de nefrologia pediátrica de nossa instituição.

O teste do nível de oxalato no plasma é necessário principalmente em casos de pacientes com hiperoxalúria, principalmente para monitorar a resposta ao tratamento ou na preparação para uma decisão sobre um transplante renal. Existem outras situações em que é importante realizar o teste conforme mencionado acima, mas são situações mais raras. Em Israel não existe nenhum laboratório que teste o nível de oxalato no plasma.

Existem vários laboratórios, entre eles o laboratório de bioquímica do Galilee Medical Center, que realizam teste de nível de oxalato na urina. O exame de urina é realizado como exame inicial em situações de suspeita de hiperoxalúria e como parte da investigação de cálculo renal.

No período anterior ao surgimento do tratamento medicamentoso para PH1, quando o tratamento definitivo era baseado no transplante de fígado, era costume monitorar apenas oxalato na urina em Israel. Nos EUA e na Europa era habitual monitorizar os níveis plasmáticos de oxalato após um transplante de fígado e, quando o nível caía para um valor próximo do normal, era recomendado proceder a um transplante de rim. Nas situações em que foram doados fígado e rim do falecido, não era aceitável adiar o transplante renal, e havia centros que realizavam diálise por um determinado período após o transplante de fígado-rim enquanto monitoravam os níveis plasmáticos de oxalato Em Israel, como mencionado, não era habitual realizar diálise após o transplante de fígado/fígado-rim e não era habitual monitorizar os níveis plasmáticos de oxalato após o transplante.

A situação mudou após a aprovação do novo tratamento medicamentoso. Lumisiren entrou na cesta de saúde em Israel em 2022 para todos os pacientes PH1. O tratamento substitui o transplante de fígado e por isso há necessidade de monitorar os níveis de oxalato no plasma nas seguintes situações:

1. Para monitorizar a resposta ao tratamento com lumsiren num doente em diálise que não urina (portanto, não é possível monitorizar a diminuição do oxalato na urina)
2. Na preparação para um transplante renal em um paciente PH1 com insuficiência renal avançada que está sendo tratado com lumsiran. De acordo com as últimas recomendações, é necessário aguardar a diminuição do oxalato no plasma para um valor inferior a 70 micromol/litro antes de um transplante renal
3. Após um transplante renal num doente tratado com lumesiren, para efeitos de avaliação do risco e da necessidade de diálise após o transplante, a fim de proteger o rim, caso existam níveis elevados de oxalato no plasma.

Testar oxalato no plasma não é simples em comparação com testar o nível na urina porque os valores na urina são uma ordem de grandeza superiores aos do plasma (na urina, valores de mmol/litro e no plasma micromol/litro) e os testes disponíveis no mercado são mais sensíveis em concentrações mais altas. Além disso, o oxalato é instável: há uma transição do ácido ascórbico para oxalato em um ambiente relativamente básico (4pH>) e, portanto, é necessária a acidificação do plasma durante a fase de preparação do teste.

O kit utilizado para testar oxalato na urina em nosso laboratório bioquímico é baseado na enzima oxalato oxidase e reação de cor (coulométrica) e foi adquirido da Biotech Trinity. De acordo com as instruções do fabricante, o kit destina-se a testar o nível de oxalato na urina. Este teste é realizado em nosso laboratório e passou por validação interna conforme instruções do fabricante.

Existem dois tipos de testes para nível de oxalato no plasma em laboratórios no mundo - Existem laboratórios que utilizam o teste enzimático baseado no kit TRINITY BIOTECH e espectrofotometria, e existem laboratórios que utilizam o método de espectrometria de massas (gás ou íons).

O segundo método (espectrometria de massa) é considerado preciso para oxalato no plasma, mas é bastante caro e não está disponível em nosso laboratório. O uso da enzima oxalato oxidase é aceito em pesquisas e para necessidades clínicas nos principais laboratórios do mundo.

No laboratório bioquímico do Hospital Universitário CHARITE, em Berlim, há um uso extensivo de testes de oxalato no plasma para fins clínicos e de pesquisa. O Laboratório e Departamento de Nefrologia do Hospital CHARITE são considerados líderes mundiais na área da hiperoxalúria e publicaram estudos onde o oxalato plasmático foi medido com o método enzimático do kit TRINITY.

Dada a necessidade de realizar um teste de plasma de oxalato em Israel, e sendo um centro líder na área de hiperoxalúria em Israel, os investigadores estão interessados ​​em colocar o teste no laboratório bioquímico de nossa instituição. De acordo com os meios disponíveis ao laboratório aqui e após testar a eficiência e confiabilidade do teste enzimático baseado em oxalato oxidase, os investigadores decidiram validar o teste de plasma de oxalato em nosso laboratório. Como o fabricante designa o kit apenas para testes de urina, não é possível realizar a validação com base nos kits de teste do fabricante e os investigadores precisaram de validação externa. Nos testes piloto realizados até o momento, os investigadores receberam valores aceitáveis ​​de acordo com a condição clínica do paciente.

O Prof. Knopf do Hospital CHARITE em Berlim concordou generosamente em realizar uma validação externa para nós para o teste de oxalato plasmático realizado em nosso laboratório bioquímico.

Métodos:

Número de amostras: serão coletadas 30 amostras de sangue, de 30 pacientes diferentes. As amostras serão coletadas de uma variedade de pacientes, a fim de obter uma ampla gama de níveis plasmáticos de oxalato. Cerca de 10 amostras serão coletadas de voluntários saudáveis, cerca de 10 amostras de pacientes em diálise sem histórico de hiperoxalúria, cerca de 5 amostras de pacientes com hiperoxalúria recebendo tratamento medicamentoso ou após transplante de fígado e cerca de 5 amostras de pacientes com insuficiência renal avançada que não estão em diálise.

O protocolo de teste – anexado no apêndice. O protocolo é compatível com o laboratório onde será realizada a validação externa.

Cada amostra será esterilizada imediatamente e o plasma será dividido em dois tubos de ensaio e mantido congelado (-80). Um tubo de ensaio será enviado para teste no laboratório em Berlim e um tubo de ensaio ficará aqui e será testado em nosso laboratório.

A etapa de tratamento da amostra até o congelamento é a mesma que será realizada aqui.

O processo de manuseio de amostras no laboratório aqui será realizado por um funcionário do laboratório.

As amostras serão enviadas congeladas ao laboratório em Berlim. A segunda etapa – tratamento da amostra após descongelamento – será realizada conforme protocolo acordado entre os dois laboratórios, a fim de evitar diferenças no tratamento da amostra. Além disso, os investigadores coordenarão os dias dos testes entre os dois laboratórios, a fim de evitar diferença decorrente do tempo de preservação das amostras no freezer.

O protocolo foi escrito em conjunto por nós com o laboratório de Berlim. O envio das amostras será financiado pela Medison Pharmaceuticals como parte do seu apoio ao projecto de sensibilização e melhoria do serviço aos pacientes com hiperoxalúria na Galileia.

Estatísticas - depois de receberem as respostas dos testes de Berlim, os investigadores compararão os resultados obtidos lá e aqui usando os seguintes testes:

Os dados quantitativos serão descritos por meio de médias e desvios padrão, mediana, intervalo interquartil (IQR) e intervalo.

Testes de comparação para amostras pareadas - para examinar as diferenças entre duas amostras pareadas usando o teste T de amostras pareadas (se as diferenças forem normalmente distribuídas) ou o teste de classificação sinalizada de Wilcoxon se a distribuição das diferenças não for normal. Um intervalo de confiança de 95% será calculado para a diferença entre as amostras pareadas.

Testes de correlação – para testar a relação entre as amostras pareadas. Teste do coeficiente de correlação de Pearson ou alternativamente teste do coeficiente de correlação de Spearman (será escolhido de acordo com o tamanho da amostra e a forma da distribuição). Gráfico de Bland-Altman e curvas de dispersão foram utilizados para demonstrar a diferença entre os resultados.

Um valor de P inferior a 5% será considerado estatisticamente significativo.

Manutenção do anonimato: as amostras serão marcadas com um código aqui fornecido, sem identificação de detalhes nos formulários ou nos tubos de ensaio. A tabela de codificação será mantida separadamente no computador do pesquisador principal e em pasta separada no armário do coordenador da pesquisa.

Consentimento informado: Os voluntários assinarão um termo de consentimento livre e esclarecido após explicação do significado do teste.