갈릴리 의료 센터 생화학 실험실에서 플라즈마 옥살산염 수준에 대한 검증 테스트

체내 옥살산염의 공급원은 간에서의 내인성 생산과 영양입니다. 옥살산염은 신장에 의해 소변으로 배설됩니다. 소변에 옥살산염이 과잉 존재하는 경우, 칼슘과 함께 결정화되어 신장에 칼슘-옥살산염 결정으로 침전되어 신장 손상을 일으킬 수 있습니다. 신장 손상이 진행된 경우 소변 내 옥살산염 분비가 손상되고 옥살산염이 혈액에 축적되어 눈, 뼈, 골수, 혈관 등 신체의 모든 조직에 침착됩니다. 체내 옥살산염 수치가 높은 상태는 중독(에틸렌 글리콜)으로 인해 발생하거나 낭포성 섬유증이나 염증성 장 질환(지방성 설사의 경우 장에서 옥살산염 흡수가 증가함)과 같은 이차성 고옥살산뇨증 상태로 인해 발생합니다. ) 또는 원발성 고옥살산뇨증의 경우.

원발성 고옥살산뇨증은 간의 옥살산염 대사 경로의 유전적 결함으로 인해 간에서 옥살산염 배설이 증가하여 발생하는 질병군입니다. 고옥살산뇨증 1형(PH1)은 전체 그룹 중에서 가장 중증이며, 생후 20년까지 대부분의 환자에서 신부전을 유발합니다. PH1의 치료는 최근까지 정상적인 효소를 회복하기 위한 간 이식을 기반으로 했으며 대부분의 경우 신장 이식도 필요했습니다. 2021년 11월, FDA는 고옥살산뇨증에 대한 획기적인 약물인 LUMASIRAN을 승인했습니다.

갈릴리 의료 센터의 소아 신장학 부서는 고수산뇨증 전문 센터입니다. 갈릴리 인구의 질병 발생률은 세계 최고 수준이며 그 결과 우리 센터에서는 질병 치료에 많은 경험이 축적되었습니다.

또한, 소아신장병동은 앨나일램(ALNYLAM)사의 임상연구 센터로 활용되어 루마시란(LUMASIRAN) 약물의 효능과 안전성을 시험하게 됐다. 현재 우리 기관의 소아 신장병동에서 모니터링을 받고 있는 8명의 PH1 환자가 (연구 또는 건강 바구니를 통해) 신약을 투여받고 있습니다.

혈장 내 옥살산염 수치 검사는 주로 고옥살산뇨증 환자의 경우 치료에 대한 반응을 모니터링하거나 신장 이식 결정을 준비하기 위한 목적으로 필요합니다. 위에서 언급한 대로 테스트를 수행하는 것이 중요한 다른 상황도 있지만 이는 드문 상황입니다. 이스라엘에는 혈장 내 옥살산염 수준을 테스트하는 실험실이 없습니다.

갈릴리 의료 센터의 생화학 실험실을 포함하여 소변에서 옥살산염 수치를 검사하는 여러 실험실이 있습니다. 소변 검사는 고옥살산뇨증이 의심되는 상황에서 초기 조사로 그리고 신장 결석 질환 ​​조사의 일부로 수행됩니다.

PH1에 대한 약물 치료법이 등장하기 전, 최종 치료법이 간 이식을 기반으로 하던 당시 이스라엘에서는 소변의 옥살산염만 모니터링하는 것이 관례였습니다. 미국과 유럽에서는 간 이식 후 혈장 옥살산 염 수치를 모니터링하는 것이 관례였으며, 수치가 정상에 가까운 수치로 떨어지면 신장 이식을 권장했습니다. 고인으로부터 간과 신장을 기증받은 상황에서 신장 이식을 연기하는 것은 용납되지 않으며, 간신장 이식 후 일정 기간 동안 혈장 옥살산 염 수치를 모니터링하면서 투석을 수행하는 센터가 이스라엘에는 다음과 같습니다. 언급한 바와 같이 간/간-신장 이식 후 투석을 수행하는 것이 관례가 아니었고 이식 후 혈장 옥살산염 수치를 모니터링하는 것도 관례가 아니었습니다.

신약 승인 이후 상황은 달라졌다. Lumisiren은 2022년 이스라엘에서 모든 PH1 환자를 대상으로 건강 바구니에 포함되었습니다. 이 치료법은 간 이식을 대체하므로 다음과 같은 상황에서 혈장 내 옥살산염 수치를 모니터링할 필요가 있습니다.

1. 소변을 보지 않는 투석 환자의 룸시렌 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위해(따라서 소변 내 옥살산염 감소를 모니터링하는 것은 불가능합니다)
2. lumsiran으로 치료를 받고 있는 진행성 신부전증을 앓고 있는 PH1 환자의 신장 이식을 준비 중입니다. 최신 권장 사항에 따르면, 신장 이식 전 혈장 내 옥살산염 수치가 70μmol/L 미만으로 감소할 때까지 기다려야 합니다.
3. 루메시렌으로 치료받은 환자의 신장 이식 후, 혈장 내 옥살산염 수치가 높은 경우 신장을 보호하기 위해 위험 평가 및 이식 후 투석의 필요성을 목적으로 합니다.

혈장 내 옥살산염을 검사하는 것은 소변 내 수치를 검사하는 것에 비해 간단하지 않습니다. 왜냐하면 소변 내 수치가 혈장(소변 수치는 mmol/리터 및 혈장 마이크로몰/리터)과 시중에서 제공되는 검사보다 훨씬 높기 때문입니다. 농도가 높을수록 더 민감합니다. 또한, 옥살산염은 불안정합니다. 비교적 염기성 환경(4pH>)에서 아스코르브산이 옥살산염으로 전이되므로 시험 준비 단계에서 혈장의 산성화가 필요합니다.

우리 생화학 실험실에서 소변의 옥살산염을 테스트하는 데 사용되는 키트는 효소 옥살산염 산화효소와 색 반응(전기량 측정)을 기반으로 하며 Biotech Trinity에서 구입했습니다. 제조업체의 지침에 따르면 이 키트는 소변의 옥살산염 수준을 테스트하기 위한 것입니다. 이 테스트는 당사 실험실에서 수행되며 제조업체의 지침에 따라 내부 검증을 거쳤습니다.

전 세계 실험실에는 두 가지 유형의 혈장 내 옥살산염 수준 테스트가 있습니다. TRINITY BIOTECH 키트와 분광 광도법을 기반으로 한 효소 테스트를 사용하는 실험실이 있고, 질량 분석 방법(가스 또는 이온)을 사용하는 실험실이 있습니다.

두 번째 방법(질량 분석법)은 혈장 내 옥살산염에 대해 정확한 것으로 간주되지만 비용이 많이 들고 우리 연구실에서는 사용할 수 없습니다. 옥살레이트 옥시다제 효소의 사용은 세계 최고의 실험실에서 연구 및 임상 요구에 따라 허용됩니다.

베를린에 있는 CHARITE 대학 병원의 생화학 실험실에서는 임상 및 연구 목적으로 혈장 내 옥살산염 테스트를 광범위하게 사용하고 있습니다. CHARITE 병원의 신장학 실험실과 부서는 고옥살산뇨증 분야의 세계적 리더로 간주되며, TRINITY 키트의 효소법을 사용하여 혈장 옥살산염을 측정한 연구를 발표했습니다.

이스라엘에서 옥살산 혈장 테스트를 수행해야 할 필요성과 이스라엘의 고옥살산뇨증 분야의 선두 센터라는 점을 고려하여 연구자들은 이 테스트를 우리 기관의 생화학 실험실에 배치하는 데 관심이 있습니다. 여기 실험실에서 사용할 수 있는 수단에 따라, 그리고 옥살산염 산화효소를 기반으로 한 효소 테스트의 효율성과 신뢰성을 테스트한 후 연구자들은 우리 실험실에서 옥살산염 혈장 테스트를 검증하기로 결정했습니다. 제조사가 소변검사만을 위한 키트를 지정하기 때문에 제조사의 테스트 키트를 기반으로 밸리데이션을 수행하는 것은 불가능하고 연구자는 외부 밸리데이션이 필요했다. 지금까지 진행된 파일럿 테스트에서 연구자들은 환자의 임상 상태에 따라 허용 가능한 값을 받았습니다.

베를린 CHARITE 병원의 Knopf 교수는 우리 생화학 실험실에서 수행된 혈장 옥살산염 테스트에 대한 외부 검증을 수행하는 데 기꺼이 동의했습니다.

행동 양식:

샘플 수: 30명의 환자로부터 총 30개의 혈액 샘플을 채취합니다. 광범위한 혈장 옥살산염 수치를 얻기 위해 다양한 환자로부터 샘플을 채취합니다. 건강한 지원자로부터 약 10개의 샘플, 고옥살산뇨증 배경이 없는 투석 환자로부터 약 10개의 샘플, 약물 치료를 받거나 간 이식 후 고옥살산뇨증 환자로부터 약 5개의 샘플, 투석을 받지 않는 진행성 신부전 환자로부터 약 5개의 샘플을 채취할 것입니다.

테스트 프로토콜 - 부록에 첨부되어 있습니다. 프로토콜은 외부 검증이 수행되는 실험실과 호환됩니다.

각 샘플은 즉시 멸균되며 혈장은 두 개의 시험관으로 나누어 냉동 보관됩니다(-80). 하나의 시험관은 테스트를 위해 베를린 실험실로 보내지고, 다른 하나는 여기에 남아 우리 실험실에서 테스트됩니다.

샘플을 동결할 때까지 처리하는 단계는 여기에서 수행되는 단계와 동일합니다.

여기 실험실의 시료 처리 과정은 한 명의 실험실 직원이 수행합니다.

샘플은 냉동 상태로 베를린에 있는 실험실로 보내질 예정입니다. 두 번째 단계인 해동 후 샘플 처리는 샘플 처리의 차이를 피하기 위해 두 실험실 간에 합의된 프로토콜에 따라 수행됩니다. 또한 연구자들은 냉동실에 보관된 샘플의 보존 시간으로 인해 발생하는 차이를 피하기 위해 두 실험실 간의 테스트 날짜를 조정할 것입니다.

프로토콜은 베를린에 있는 실험실과 우리가 공동으로 작성했습니다. 샘플 배송은 갈릴리 지역의 고옥살산뇨증 환자에 대한 인식을 제고하고 서비스를 개선하기 위한 프로젝트 지원의 일환으로 Medison Pharmaceuticals에서 자금을 조달할 것입니다.

통계 - 베를린에서 테스트 답변을 받은 후 조사관은 다음 테스트를 사용하여 베를린과 여기에서 얻은 결과를 비교할 것입니다.

정량적 데이터는 평균, 표준 편차, 중앙값, 사분위간 범위(IQR) 및 범위를 사용하여 설명됩니다.

쌍 표본에 대한 비교 검정 - 쌍 표본 T 검정(차이가 정규 분포인 경우) 또는 차이 분포가 정규 분포가 아닌 경우 Wilcoxon 부호 순위 검정을 사용하여 두 쌍 표본 간의 차이를 검사합니다. 쌍을 이루는 샘플 간의 차이에 대해 95% 신뢰 구간이 계산됩니다.

상관 테스트 - 쌍을 이루는 샘플 간의 관계를 테스트합니다. Pearson의 상관 계수 테스트 또는 Spearman의 상관 계수 테스트(샘플의 크기와 분포의 모양에 따라 선택됨) Bland-Altman 플롯과 Scatter 플롯 곡선을 사용하여 결과 간의 차이를 보여주었습니다.

5%보다 낮은 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

익명성 유지: 양식이나 시험관에 대한 세부 정보를 식별하지 않고 샘플에 여기에 제공된 코드가 표시됩니다. 코딩 테이블은 수석 연구원의 컴퓨터와 연구 코디네이터의 옷장에 있는 별도의 바인더에 별도로 보관됩니다.

사전 동의: 지원자는 테스트의 의미를 설명한 후 사전 동의서에 서명합니다.