Valideringstest för plasmaoxalatnivå i ett biokemiskt laboratorium vid Galilee Medical Center

Källan till oxalat i kroppen är endogen produktion i levern och näring. Oxalatet utsöndras i urinen via njurarna. I situationer där det finns överskott av oxalat i urinen kan det kristallisera tillsammans med kalcium och lägga sig som kalciumoxalatkristaller i njuren och orsaka njurskador. Om det finns en avancerad njurskada försämras utsöndringen av oxalat i urinen, och oxalatet ackumuleras i blodet och avlagringar i kroppens alla vävnader, inklusive ögon, ben, benmärg, blodkärl med mera. Tillstånd där det finns en hög nivå av oxalat i kroppen orsakas av förgiftning (etylenglykol) eller tillstånd av sekundär hyperoxaluri såsom vid cystisk fibros eller inflammatoriska tarmsjukdomar (det finns ökad absorption av oxalat i tarmen i fall av fet diarré ) eller vid primär hyperoxaluri.

Primär hyperoxaluri är en grupp sjukdomar som orsakas av ökad utsöndring av oxalat i levern, på grund av en genetisk defekt i oxalatmetabolismen i levern. Hyperoxaluri typ 1 (PH1) är den allvarligaste av hela gruppen och orsakar njursvikt hos de flesta patienter under det andra decenniet av livet. Behandlingen av PH1 baserades tills nyligen på en levertransplantation för att återställa ett normalt enzym och i de flesta fall krävdes även en njurtransplantation. I november 2021 godkände FDA ett banbrytande läkemedel mot hyperoxaluri, LUMASIRAN.

Pediatric Nephrology Unit vid Galilee Medical Center är ett specialistcentrum för hyperoxaluri. Förekomsten av sjukdomen i befolkningen i Galileen är en av de högsta i världen och som ett resultat har mycket erfarenhet samlats på att behandla sjukdomen i vårt centrum.

Den pediatriska nefrologienheten användes också som ett centrum i ALNYLAM-företagets kliniska forskning för att testa effektiviteten och säkerheten av läkemedlet LUMASIRAN. Det finns nu åtta PH1-patienter som får det nya läkemedlet (genom forskning eller genom hälsokorgen) som övervakas på den pediatriska nefrologiska enheten på vår institution.

Testning av oxalatnivån i plasma krävs främst i fall av hyperoxaluripatienter, främst i syfte att övervaka svaret på behandlingen eller för att förbereda ett beslut om en njurtransplantation. Det finns andra situationer där det är viktigt att utföra testet som nämnts ovan, men det är ovanligare situationer. I Israel finns det inget laboratorium som testar halten av oxalat i plasma.

Det finns flera laboratorier, bland dem biokemilaboratoriet vid Galilee Medical Center, som utför ett oxalatnivåtest i urinen. Urinprovet görs som en första kartläggning i situationer där hyperoxaluri misstänks och som ett led i utredningen av njurstenssjukdom.

Under perioden före uppkomsten av läkemedelsbehandlingen för PH1, när den definitiva behandlingen baserades på en levertransplantation, var det brukligt att endast övervaka oxalat i urinen i Israel. I USA och Europa var det brukligt att övervaka plasmaoxalatnivåerna efter en levertransplantation och när nivån sjönk till ett värde nära det normala rekommenderades att gå vidare med en njurtransplantation. I situationer där en lever och njure donerades från den avlidne var det inte acceptabelt att skjuta upp njurtransplantationen, och det fanns centra som brukade utföra dialys under en viss period efter lever-njurtransplantation samtidigt som man övervakade plasmaoxalatnivåerna i Israel, som nämnt, var det inte brukligt att utföra dialys efter lever/lever-njurtransplantation och det var inte brukligt att övervaka plasmaoxalatnivåer efter transplantation.

Situationen förändrades efter godkännandet av den nya läkemedelsbehandlingen. Lumisiren kom in i hälsokorgen i Israel 2022 för alla PH1-patienter. Behandlingen ersätter levertransplantationen och som ett resultat av detta finns ett behov av att övervaka oxalatnivåerna i plasman i följande situationer:

1. Att övervaka svaret på lumsirenbehandling hos en dialyspatient som inte kissar (det är därför inte möjligt att övervaka minskningen av oxalat i urinen)
2. Som förberedelse för en njurtransplantation hos en PH1-patient med avancerad njursvikt som behandlas med lumsiran. Enligt de senaste rekommendationerna är det nödvändigt att vänta på minskningen av oxalat i plasman till ett värde lägre än 70 mikromol/liter innan en njurtransplantation
3. Efter en njurtransplantation hos en patient behandlad med lumesiren, i syfte att riskbedömning och behov av dialys efter transplantationen för att skydda njuren om det finns höga halter av oxalat i plasman.

Att testa oxalat i plasma är inte enkelt jämfört med att testa nivån i urin eftersom värdena i urin är en storleksordning högre än i plasma (i urinvärden på mmol/liter och i plasma mikromol/liter) och de tester som finns på marknaden är känsligare vid högre koncentrationer. Dessutom är oxalat instabilt: det sker en övergång av askorbinsyra till oxalat i en relativt basisk miljö (4pH>) och därför krävs surgöring av plasman under testberedningsfasen.

Kitet som används för att testa oxalat i urin i vårt biokemiska laboratorium är baserat på enzymet oxalatoxidas och färgreaktion (coulometrisk) och köptes från Biotech Trinity. Enligt tillverkarens instruktioner är kitet avsett för att testa oxalatnivån i urin. Detta test utförs i vårt laboratorium och har genomgått intern validering enligt tillverkarens instruktioner.

Det finns två typer av tester för oxalatnivå i plasma i laboratorier i världen – Det finns laboratorier som använder det enzymatiska testet baserat på TRINITY BIOTECH kit och spektrofotometri, och det finns laboratorier som använder masspektrometrimetoden (gas eller joner).

Den andra metoden (masspektrometri) anses korrekt för oxalat i plasma men är ganska dyr och inte tillgänglig för vårt laboratorium. Användningen av oxalatoxidasenzym är accepterad inom forskning och för kliniska behov i ledande laboratorier i världen.

I det biokemiska laboratoriet på CHARITE Universitetssjukhuset i Berlin, används en omfattande användning av oxalat-tester i plasma för kliniska och forskningsändamål. Nefrologiska laboratoriet och avdelningen vid CHARITE-sjukhuset anses vara världsledande inom området hyperoxaluri, och publicerade studier där plasmaoxalat mättes med den enzymatiska metoden i TRINITY-kitet.

Med tanke på behovet av att utföra ett oxalatplasmatest i Israel, och eftersom det är ett ledande center inom området hyperoxaluri i Israel, är utredarna intresserade av att placera testet i det biokemiska laboratoriet vid vår institution. I enlighet med de medel som finns tillgängliga för laboratoriet här och efter att ha testat effektiviteten och tillförlitligheten av det enzymatiska testet baserat på oxalatoxidas, beslutade utredarna att validera oxalatplasmatestet i vårt laboratorium. Eftersom tillverkaren utser kitet endast för urintestning är det inte möjligt att utföra validering baserat på tillverkarens testkit och utredarna behövde extern validering. I de hittills genomförda pilottesterna har utredarna fått acceptabla värden beroende på patientens kliniska tillstånd.

Prof. Knopf från CHARITE Hospital i Berlin gick generöst med på att utföra en extern validering åt oss för plasmaoxalattestet som utfördes i vårt biokemiska laboratorium.

Metoder:

Antal prover: totalt 30 blodprover kommer att tas, från 30 olika patienter. Proverna kommer att tas från en mängd olika patienter för att erhålla ett brett spektrum av plasmaoxalatnivåer. Cirka 10 prover kommer att tas från friska frivilliga, cirka 10 prover från dialyspatienter utan bakgrund av hyperoxaluri, cirka 5 prover från hyperoxaluripatienter som får läkemedelsbehandling eller efter en levertransplantation och cirka 5 prover från patienter med avancerad njursvikt som inte är i dialys.

Testprotokollet – bifogat i bilagan. Protokollet är kompatibelt med laboratoriet där den externa valideringen kommer att utföras.

Varje prov kommer att steriliseras omedelbart och plasman delas upp i två provrör och förvaras fryst (-80). Ett provrör kommer att skickas för testning i laboratoriet i Berlin och ett provrör kommer att stanna här och testas i vårt laboratorium.

Steget att behandla provet tills det fryses är detsamma som det kommer att utföras här.

Provhanteringsprocessen i laboratoriet här kommer att utföras av en laboratorieanställd.

Proverna kommer att skickas frysta till laboratoriet i Berlin. Det andra steget - behandling av provet efter upptining - kommer att utföras enligt ett överenskommet protokoll mellan de två laboratorierna, för att undvika skillnader i behandlingen av provet. Utredarna kommer också att samordna dagarna för testerna mellan de två laboratorierna för att undvika skillnader som uppstår på grund av konserveringstiden för proverna i frysen.

Protokollet skrevs gemensamt av oss med laboratoriet i Berlin. Leveransen av proverna kommer att finansieras av Medison Pharmaceuticals som en del av dess stöd till projektet för att öka medvetenheten och förbättra servicen för patienter med hyperoxaluri i Galileen.

Statistik - efter att ha mottagit testsvaren från Berlin kommer utredarna att jämföra resultaten som erhållits där och här med hjälp av följande test:

Kvantitativa data kommer att beskrivas med hjälp av medelvärden och standardavvikelser, median, interkvartilt intervall (IQR) och intervall.

Jämförelsetest för parade prover - för att undersöka skillnaderna mellan två parade prover med hjälp av det parade provet T-testet (om skillnaderna är normalfördelade) eller Wilcoxons signerade rangtest om fördelningen av skillnaderna inte är normal. Ett 95 % konfidensintervall kommer att beräknas för skillnaden mellan de parade proverna.

Korrelationstester - för att testa förhållandet mellan de parade proverna. Pearsons korrelationskoefficienttest eller alternativt Spearmans korrelationskoefficienttest (kommer att väljas efter storleken på provet och formen på fördelningen) Bland-Altman plot och Scatter plot kurvor användes för att visa skillnaden mellan resultaten.

Ett P-värde lägre än 5 % kommer att anses vara statistiskt signifikant.

Upprätthålla anonymitet: proverna kommer att märkas med en kod som anges här, utan att identifiera detaljer på formulären eller provrören. Kodningstabellen kommer att förvaras separat på huvudforskarens dator och i en separat pärm i forskningssamordnarens garderob.

Informerat samtycke: Volontärerna kommer att underteckna ett informerat samtycke efter en förklaring av testets innebörd.