Проверка уровня оксалатов в плазме в биохимической лаборатории Медицинского центра Галилеи

Источником оксалатов в организме является эндогенное производство в печени и питание. Оксалат выводится с мочой почками. В ситуациях, когда в моче имеется избыток оксалатов, они могут кристаллизоваться вместе с кальцием и оседать в виде кристаллов оксалата кальция в почках и вызывать повреждение почек. При тяжелом поражении почек секреция оксалатов с мочой нарушается, оксалат накапливается в крови и откладывается во всех тканях организма, включая глаза, кости, костный мозг, кровеносные сосуды и многое другое. Состояния, при которых в организме наблюдается высокий уровень оксалатов, вызваны отравлением (этиленгликолем) или состояниями вторичной гипероксалурии, например, при муковисцидозе или воспалительных заболеваниях кишечника (при жировой диарее наблюдается повышенное всасывание оксалатов в кишечнике). ) или при первичной гипероксалурии.

Первичная гипероксалурия — группа заболеваний, вызванных повышенным выделением оксалатов печенью вследствие генетического дефекта пути метаболизма оксалатов в печени. Гипероксалурия 1-го типа (ПГ1) является наиболее тяжелой из всей группы и вызывает почечную недостаточность у большинства пациентов ко второму десятилетию жизни. Лечение PH1 до недавнего времени основывалось на трансплантации печени с целью восстановления нормального фермента, а в большинстве случаев также требовалась трансплантация почки. В ноябре 2021 года FDA одобрило революционный препарат от гипероксалурии — ЛУМАСИРАН.

Отделение детской нефрологии Медицинского центра Галилеи является специализированным центром по лечению гипероксалурии. Заболеваемость населения Галилеи одна из самых высоких в мире, в результате чего накоплен большой опыт лечения заболевания в нашем центре.

Также отделение детской нефрологии использовалось в качестве центра клинических исследований компании АЛНИЛАМ по проверке эффективности и безопасности препарата ЛУМАСИРАН. В настоящее время восемь пациентов с ЛГ1, получающих новый препарат (в рамках исследований или через корзину здоровья), находятся под наблюдением в педиатрическом нефрологическом отделении нашего учреждения.

Тестирование уровня оксалатов в плазме требуется в основном у пациентов с гипероксалурией, главным образом с целью контроля ответа на лечение или при подготовке к решению о трансплантации почки. Существуют и другие ситуации, в которых важно выполнить упомянутый выше тест, но это более редкие ситуации. В Израиле нет лаборатории, проверяющей уровень оксалатов в плазме.

Есть несколько лабораторий, в том числе лаборатория биохимии Медицинского центра Галилеи, которые проводят тест на уровень оксалатов в моче. Анализ мочи проводится в качестве первичного обследования при подозрении на гипероксалурию и в рамках расследования мочекаменной болезни.

В период до появления медикаментозного лечения ПГ1, когда окончательное лечение основывалось на трансплантации печени, в Израиле было принято контролировать только оксалат в моче. В США и Европе после трансплантации печени было принято контролировать уровень оксалатов в плазме, и когда уровень падал до значения, близкого к норме, рекомендовалось приступать к трансплантации почки. В ситуациях, когда печень и почка были донорами от умершего, откладывать трансплантацию почки было неприемлемо, и существовали центры, которые проводили диализ в течение определенного периода после трансплантации печени и почек, одновременно контролируя уровень оксалатов в плазме. Как уже упоминалось, не принято проводить диализ после трансплантации печени/печени-почки и не принято контролировать уровень оксалатов в плазме после трансплантации.

Ситуация изменилась после одобрения нового лекарственного препарата. Люмисирен вошел в корзину здравоохранения в Израиле в 2022 году для всех пациентов с ЛГ1. Лечение заменяет трансплантацию печени, в результате чего возникает необходимость контроля уровня оксалатов в плазме в следующих ситуациях:

1. Для мониторинга ответа на лечение люмсиреном у диализного пациента, который не мочится (поэтому невозможно отслеживать снижение оксалатов в моче).
2. При подготовке к трансплантации почки у пациента PH1 с выраженной почечной недостаточностью, получающего лечение люмсираном. Согласно последним рекомендациям, перед трансплантацией почки необходимо дождаться снижения оксалатов в плазме до значения ниже 70 микромоль/л.
3. После трансплантации почки у пациента, получающего люмесирен, с целью оценки риска и необходимости проведения диализа после трансплантации с целью защиты почки при высоком уровне оксалатов в плазме.

Тестирование оксалатов в плазме не так просто по сравнению с тестированием уровня в моче, поскольку значения в моче на порядок выше, чем в плазме (значения в моче ммоль/литр и в микромоль/литр в плазме), а тесты, доступные на рынке более чувствительны при более высоких концентрациях. Кроме того, оксалат нестабилен: происходит переход аскорбиновой кислоты в оксалат в относительно основной среде (4pH>) и поэтому на этапе приготовления теста требуется подкисление плазмы.

Набор, используемый для тестирования оксалата в моче в нашей биохимической лаборатории, основан на ферменте оксалатоксидазе и цветной реакции (кулонометрическом) и был приобретен у Biotech Trinity. Согласно инструкции производителя набор предназначен для определения уровня оксалатов в моче. Этот тест проводится в нашей лаборатории и прошел внутреннюю проверку в соответствии с инструкциями производителя.

В лабораториях мира существует два типа тестов на уровень оксалатов в плазме – есть лаборатории, использующие ферментативный тест на основе набора TRINITY BIOTECH и спектрофотометрию, и есть лаборатории, использующие метод масс-спектрометрии (газовой или ионной).

Второй метод (масс-спектрометрия) считается точным для определения оксалатов в плазме, но он достаточно дорог и недоступен для нашей лаборатории. Использование фермента оксалатоксидазы принято в научных исследованиях и для клинических нужд в ведущих лабораториях мира.

В биохимической лаборатории университетской больницы CHARITE в Берлине широко используются тесты на оксалат в плазме в клинических и исследовательских целях. Нефрологическая лаборатория и отделение больницы CHARITE считаются мировыми лидерами в области гипероксалурии и опубликовали исследования, в которых оксалаты плазмы измерялись ферментативным методом в наборе TRINITY.

Учитывая необходимость проведения анализа оксалатной плазмы в Израиле и будучи ведущим центром в области гипероксалурии в Израиле, исследователи заинтересованы в размещении теста в биохимической лаборатории нашего учреждения. В соответствии с имеющимися в распоряжении лаборатории средствами и после проверки эффективности и надежности ферментативного теста на основе оксалатоксидазы исследователи решили валидировать тест оксалатной плазмы в нашей лаборатории. Поскольку производитель назначает набор только для анализа мочи, невозможно провести валидацию на основе тест-наборов производителя, и исследователям потребовалась внешняя проверка. В ходе пилотных испытаний, проведенных на данный момент, исследователи получили приемлемые значения в зависимости от клинического состояния пациента.

Профессор Кнопф из больницы CHARITE в Берлине любезно согласился провести для нас внешнюю валидацию теста на оксалат в плазме, проводимого в нашей биохимической лаборатории.

Методы:

Количество образцов: всего будет взято 30 образцов крови у 30 разных пациентов. Образцы будут взяты у разных пациентов, чтобы получить широкий диапазон уровней оксалатов в плазме. Около 10 образцов будут взяты у здоровых добровольцев, около 10 образцов у диализных пациентов без гипероксалурии, около 5 образцов у пациентов с гипероксалурией, получающих медикаментозное лечение или после трансплантации печени, и около 5 образцов у пациентов с почечной недостаточностью на поздних стадиях, не находящихся на диализе.

Протокол испытаний – прилагается в приложении. Протокол совместим с лабораторией, в которой будет проводиться внешняя валидация.

Каждый образец будет немедленно стерилизован, а плазма будет разделена на две пробирки и сохранена замороженной (-80). Одна пробирка будет отправлена ​​на тестирование в лабораторию в Берлине, а другая останется здесь и будет проверена в нашей лаборатории.

Этап обработки образца до замораживания такой же, как и здесь.

Процесс обработки проб в лаборатории здесь будет выполнять один сотрудник лаборатории.

Образцы будут отправлены в замороженном виде в лабораторию в Берлине. Второй этап — обработка образца после оттаивания — будет осуществляться в соответствии с протоколом, согласованным между двумя лабораториями, чтобы избежать различий в обработке образца. Также следователи согласуют дни проведения анализов между двумя лабораториями, чтобы избежать разницы, возникающей из-за времени хранения образцов в морозильной камере.

Протокол написан нами совместно с лабораторией в Берлине. Отгрузка образцов будет профинансирована Medison Pharmaceuticals в рамках поддержки проекта по повышению осведомленности и улучшению обслуживания пациентов с гипероксалурией в Галилее.

Статистика – после получения ответов на тесты из Берлина следователи сравнит результаты, полученные там и здесь, с помощью следующих тестов:

Количественные данные будут описаны с использованием средних значений и стандартных отклонений, медианы, межквартильного диапазона (IQR) и диапазона.

Критерии сравнения парных выборок — для изучения различий между двумя парными выборками с использованием Т-критерия парной выборки (если различия нормально распределяются) или знакового рангового критерия Уилкоксона, если распределение различий не является нормальным. Для разницы между парными выборками будет рассчитан 95% доверительный интервал.

Корреляционные тесты — для проверки связи между парными выборками. Тест коэффициента корреляции Пирсона или, альтернативно, тест коэффициента корреляции Спирмена (будет выбран в зависимости от размера выборки и формы распределения). Для демонстрации разницы между результатами использовались график Бланда-Альтмана и кривые диаграммы рассеяния.

Значение P ниже 5% будет считаться статистически значимым.

Сохранение анонимности: образцы будут отмечены кодом, указанным здесь, без указания деталей в формах или пробирках. Таблица кодирования будет храниться отдельно на компьютере главного исследователя и в отдельной папке в шкафу координатора исследования.

Информированное согласие: Добровольцы подпишут форму информированного согласия после объяснения значения теста.