Test di validazione per il livello di ossalato plasmatico in un laboratorio biochimico presso il Galilee Medical Center

La fonte di ossalato nel corpo è la produzione endogena nel fegato e la nutrizione. L'ossalato viene escreto nelle urine dai reni. In situazioni in cui è presente un eccesso di ossalato nelle urine, questo può cristallizzare insieme al calcio e depositarsi come cristalli di ossalato di calcio nel rene e causare danni ai reni. Se c'è un danno renale avanzato, la secrezione di ossalato nelle urine è compromessa e l'ossalato si accumula nel sangue e si deposita in tutti i tessuti del corpo, inclusi occhi, ossa, midollo osseo, vasi sanguigni e altro. Condizioni in cui è presente un elevato livello di ossalato nel corpo sono causate da avvelenamento (glicole etilenico) o condizioni di iperossaluria secondaria come nella fibrosi cistica o nelle malattie infiammatorie intestinali (si verifica un aumento dell'assorbimento di ossalato nell'intestino in caso di diarrea grassa ) o nell'iperossaluria primaria.

L'iperossaluria primaria è un gruppo di malattie causate da un'aumentata escrezione di ossalato da parte del fegato, a causa di un difetto genetico nella via del metabolismo dell'ossalato nel fegato. L'iperossaluria di tipo 1 (PH1) è la più grave dell'intero gruppo e causa insufficienza renale nella maggior parte dei pazienti entro la seconda decade di vita. Fino a poco tempo fa il trattamento della PH1 si basava sul trapianto di fegato per ripristinare un enzima normale e nella maggior parte dei casi era necessario anche il trapianto di rene. Nel novembre 2021, la FDA ha approvato un farmaco rivoluzionario per l'iperossaluria, LUMASIRAN.

L'Unità di Nefrologia Pediatrica del Galilee Medical Center è un centro specializzato in iperossaluria. L'incidenza della malattia nella popolazione della Galilea è una delle più alte al mondo e di conseguenza è stata accumulata molta esperienza nel trattamento della malattia nel nostro centro.

Inoltre, l'unità di nefrologia pediatrica è stata utilizzata come centro di ricerca clinica della società ALNYLAM per testare l'efficacia e la sicurezza del farmaco LUMASIRAN. Attualmente ci sono otto pazienti PH1 che ricevono il nuovo farmaco (attraverso la ricerca o attraverso il paniere sanitario) che vengono monitorati nell'unità di nefrologia pediatrica del nostro istituto.

Il test del livello di ossalato nel plasma è necessario principalmente nei pazienti con iperossaluria, principalmente allo scopo di monitorare la risposta al trattamento o in preparazione alla decisione su un trapianto di rene. Esistono altre situazioni in cui è importante eseguire il test come menzionato sopra, ma queste sono situazioni più rare. In Israele non esiste un laboratorio che controlli il livello di ossalato nel plasma.

Esistono diversi laboratori, tra cui il laboratorio di biochimica del Galilee Medical Center, che eseguono un test del livello di ossalato nelle urine. L'esame delle urine viene eseguito come indagine iniziale in situazioni in cui si sospetta iperossaluria e come parte dell'indagine sulla malattia dei calcoli renali.

Nel periodo precedente alla comparsa della terapia farmacologica per la PH1, quando la cura definitiva si basava sul trapianto di fegato, in Israele era consuetudine monitorare solo l'ossalato nelle urine. Negli USA e in Europa era consuetudine monitorare i livelli plasmatici di ossalato dopo un trapianto di fegato e quando il livello scendeva ad un valore vicino alla norma si consigliava di procedere con un trapianto di rene. Nelle situazioni in cui un fegato e un rene venivano donati da un defunto, non era accettabile ritardare il trapianto di rene, ed esistevano centri che eseguivano la dialisi per un certo periodo dopo il trapianto di fegato-rene monitorando i livelli di ossalato plasmatico in Israele, come menzionato, non era consuetudine eseguire la dialisi dopo il trapianto di fegato/fegato-rene e non era consuetudine monitorare i livelli di ossalato plasmatico dopo il trapianto.

La situazione è cambiata dopo l'approvazione del nuovo trattamento farmacologico. Lumisiren è entrato nel paniere sanitario in Israele nel 2022 per tutti i pazienti PH1. Il trattamento sostituisce il trapianto di fegato e di conseguenza è necessario monitorare i livelli di ossalato nel plasma nelle seguenti situazioni:

1. Per monitorare la risposta al trattamento con lumsiren in un paziente in dialisi che non urina (non è quindi possibile monitorare la diminuzione dell'ossalato nelle urine)
2. In preparazione per un trapianto di rene in un paziente PH1 con insufficienza renale avanzata in trattamento con lumsiran. Secondo le ultime raccomandazioni è necessario attendere la diminuzione dell'ossalato nel plasma ad un valore inferiore a 70 micromoli/litro prima di effettuare un trapianto di rene
3. Dopo un trapianto di rene in un paziente trattato con lumesiren, ai fini della valutazione del rischio e della necessità di dialisi dopo il trapianto al fine di proteggere il rene se sono presenti elevati livelli di ossalato nel plasma.

Testare l'ossalato nel plasma non è semplice rispetto a testarne il livello nelle urine perché i valori nelle urine sono un ordine di grandezza superiori a quelli nel plasma (valori nelle urine di mmol/litro e nel plasma micromol/litro) e i test disponibili sul mercato sono più sensibili alle concentrazioni più elevate. Inoltre l'ossalato è instabile: avviene la transizione dell'acido ascorbico ad ossalato in un ambiente relativamente basico (4pH>) e quindi è necessaria l'acidificazione del plasma durante la fase di preparazione del test.

Il kit utilizzato per testare l'ossalato nelle urine nel nostro laboratorio biochimico si basa sull'enzima ossalato ossidasi e sulla reazione cromatica (coulometrica) ed è stato acquistato da Biotech Trinity. Secondo le istruzioni del produttore, il kit è destinato a testare il livello di ossalato nelle urine. Questo test viene eseguito nel nostro laboratorio ed è stato sottoposto a validazione interna secondo le istruzioni del produttore.

Esistono due tipi di test per il livello di ossalato nel plasma nei laboratori di tutto il mondo: ci sono laboratori che utilizzano il test enzimatico basato sul kit TRINITY BIOTECH e la spettrofotometria, e ci sono laboratori che utilizzano il metodo della spettrometria di massa (gas o ioni).

Il secondo metodo (spettrometria di massa) è considerato accurato per l'ossalato nel plasma ma è piuttosto costoso e non disponibile per il nostro laboratorio. L'uso dell'enzima ossalato ossidasi è accettato nella ricerca e per esigenze cliniche nei principali laboratori del mondo.

Nel laboratorio biochimico dell'ospedale universitario CHARITE di Berlino si fa ampio uso dei test dell'ossalato nel plasma per scopi clinici e di ricerca. Il Laboratorio e il Dipartimento di Nefrologia dell'Ospedale CHARITE sono considerati leader mondiali nel campo dell'iperossaluria e hanno pubblicato studi in cui l'ossalato plasmatico è stato misurato con il metodo enzimatico nel kit TRINITY.

Data la necessità di eseguire un test plasmatico di ossalato in Israele, ed essendo un centro leader nel campo dell'iperossaluria in Israele, i ricercatori sono interessati a collocare il test nel laboratorio biochimico del nostro istituto. In base ai mezzi a disposizione del laboratorio e dopo aver testato l'efficienza e l'affidabilità del test enzimatico basato sull'ossalato ossidasi, i ricercatori hanno deciso di convalidare il test al plasma di ossalato nel nostro laboratorio. Poiché il produttore designa il kit solo per il test delle urine, non è possibile eseguire la validazione basata sui kit di test del produttore e gli investigatori necessitano di una validazione esterna. Nei test pilota condotti finora, i ricercatori hanno ottenuto valori accettabili in base alle condizioni cliniche del paziente.

Il Prof. Knopf dell'Ospedale CHARITE di Berlino ha generosamente accettato di eseguire per noi una validazione esterna per il test dell'ossalato plasmatico eseguito nel nostro laboratorio biochimico.

Metodi:

Numero di campioni: verranno prelevati un totale di 30 campioni di sangue, da 30 pazienti diversi. I campioni verranno prelevati da una varietà di pazienti al fine di ottenere un'ampia gamma di livelli di ossalato plasmatico. Verranno prelevati circa 10 campioni da volontari sani, circa 10 campioni da pazienti in dialisi senza precedenti di iperossaluria, circa 5 campioni da pazienti con iperossaluria sottoposti a trattamento farmacologico o dopo un trapianto di fegato e circa 5 campioni da pazienti con insufficienza renale avanzata non in dialisi.

Il protocollo del test - allegato in appendice. Il protocollo è compatibile con il laboratorio in cui verrà eseguita la validazione esterna.

Ciascun campione verrà immediatamente sterilizzato e il plasma verrà diviso in due provette e conservato congelato (-80). Una provetta verrà inviata per essere testata nel laboratorio di Berlino, mentre l'altra provetta rimarrà qui e sarà testata nel nostro laboratorio.

La fase di trattamento del campione fino al congelamento è la stessa che verrà eseguita qui.

Il processo di manipolazione dei campioni nel laboratorio qui sarà eseguito da un dipendente del laboratorio.

I campioni verranno inviati congelati al laboratorio di Berlino. La seconda fase - trattamento del campione dopo lo scongelamento - verrà effettuata secondo un protocollo concordato tra i due laboratori, al fine di evitare differenze nel trattamento del campione. Inoltre, i ricercatori coordineranno i giorni dei test tra i due laboratori per evitare differenze derivanti dal tempo di conservazione dei campioni nel congelatore.

Il protocollo è stato scritto da noi insieme al laboratorio di Berlino. La spedizione dei campioni sarà finanziata da Medison Pharmaceuticals come parte del suo sostegno al progetto di sensibilizzazione e miglioramento del servizio per i pazienti con iperossaluria in Galilea.

Statistiche: dopo aver ricevuto le risposte ai test da Berlino, gli investigatori confronteranno i risultati ottenuti lì e qui utilizzando i seguenti test:

I dati quantitativi verranno descritti utilizzando medie e deviazioni standard, mediana, intervallo interquartile (IQR) e intervallo.

Test comparativi per campioni accoppiati - per esaminare le differenze tra due campioni accoppiati utilizzando il test T del campione accoppiato (se le differenze sono distribuite normalmente) o il test dei ranghi con segno di Wilcoxon se la distribuzione delle differenze non è normale. Verrà calcolato un intervallo di confidenza al 95% per la differenza tra i campioni accoppiati.

Test di correlazione: per testare la relazione tra i campioni accoppiati. Il test del coefficiente di correlazione di Pearson o in alternativa il test del coefficiente di correlazione di Spearman (sarà scelto in base alla dimensione del campione e alla forma della distribuzione). Le curve del diagramma di Bland-Altman e del diagramma di dispersione sono state utilizzate per dimostrare la differenza tra i risultati.

Un valore P inferiore al 5% sarà considerato statisticamente significativo.

Mantenimento dell'anonimato: i campioni verranno contrassegnati con un codice qui riportato, senza dettagli identificativi sulle schede o sulle provette. La tabella di codifica sarà conservata separatamente sul computer del ricercatore principale e in un raccoglitore separato nell'armadio del coordinatore della ricerca.

Consenso informato: i volontari firmeranno un modulo di consenso informato dopo una spiegazione del significato del test.