Test walidacyjny poziomu szczawianów w osoczu w laboratorium biochemicznym w Galilee Medical Center

Źródłem szczawianu w organizmie jest endogenna produkcja w wątrobie oraz odżywianie. Szczawian jest wydalany z moczem przez nerki. W sytuacjach, gdy w moczu występuje nadmiar szczawianu, może on krystalizować razem z wapniem i osadzać się w nerkach w postaci kryształów szczawianu wapnia, powodując uszkodzenie nerek. W przypadku zaawansowanego uszkodzenia nerek wydzielanie szczawianu z moczem jest zaburzone, a szczawian gromadzi się we krwi i osadza się we wszystkich tkankach organizmu, w tym w oczach, kościach, szpiku kostnym, naczyniach krwionośnych i innych. Stany, w których występuje wysoki poziom szczawianów w organizmie, spowodowane są zatruciem (glikolem etylenowym) lub stanami wtórnej hiperoksalurii, np. w mukowiscydozie lub chorobach zapalnych jelit (w przypadku biegunki tłuszczowej następuje zwiększone wchłanianie szczawianów w jelitach) ) lub w pierwotnej hiperoksalurii.

Hiperoksaluria pierwotna to grupa chorób spowodowanych zwiększonym wydalaniem szczawianów przez wątrobę, wynikającą z defektu genetycznego szlaku metabolizmu szczawianów w wątrobie. Hiperoksaluria typu 1 (PH1) jest najcięższą z całej grupy i powoduje niewydolność nerek u większości pacjentów w drugiej dekadzie życia. Leczenie PH1 do niedawna opierało się na przeszczepie wątroby w celu przywrócenia prawidłowego funkcjonowania enzymu, a w większości przypadków konieczny był także przeszczep nerki. W listopadzie 2021 roku FDA zatwierdziła przełomowy lek na hiperoksalurię – LUMASIRAN.

Oddział Nefrologii Dziecięcej w Galilee Medical Center jest ośrodkiem specjalistycznym zajmującym się hiperoksalurią. Zachorowalność na tę chorobę w populacji Galilei jest jedną z najwyższych na świecie, dzięki czemu zgromadziliśmy duże doświadczenie w leczeniu tej choroby w naszym ośrodku.

Oddział nefrologii dziecięcej był także ośrodkiem badań klinicznych firmy ALNYLAM mających na celu sprawdzenie skuteczności i bezpieczeństwa leku LUMASIRAN. Obecnie ośmiu pacjentów z PH1 otrzymuje nowy lek (w ramach badań lub z koszyka opieki zdrowotnej), którzy są monitorowani na oddziale nefrologii dziecięcej naszej placówki.

Badanie poziomu szczawianów w osoczu wymagane jest głównie u pacjentów z hiperoksalurią, głównie w celu monitorowania odpowiedzi na leczenie lub przygotowania do podjęcia decyzji o przeszczepieniu nerki. Istnieją inne sytuacje, w których ważne jest wykonanie badania, jak wspomniano powyżej, ale są to rzadsze sytuacje. W Izraelu nie ma laboratorium, które badałoby poziom szczawianów w osoczu.

Istnieje kilka laboratoriów, w tym laboratorium biochemiczne w Galilee Medical Center, które wykonują badanie poziomu szczawianów w moczu. Badanie moczu wykonuje się jako badanie wstępne w sytuacjach podejrzenia hiperoksalurii oraz w ramach diagnostyki kamicy nerkowej.

W okresie przed pojawieniem się terapii farmakologicznej na PH1, kiedy ostateczne leczenie opierało się na przeszczepieniu wątroby, w Izraelu zwyczajowo monitorowano w moczu jedynie szczawian. W USA i Europie zwyczajowo monitorowano stężenie szczawianów w osoczu po przeszczepieniu wątroby, a gdy poziom ten spadł do wartości zbliżonej do normy, zalecano kontynuację przeszczepu nerki. W sytuacjach, gdy od zmarłego pobierano wątrobę i nerkę, niedopuszczalne było zwlekanie z przeszczepieniem nerki, a istniały ośrodki, które po przeszczepieniu wątroby i nerki wykonywały dializy przez pewien okres, monitorując jednocześnie poziom szczawianów w osoczu. wspomniano, nie było zwyczaju przeprowadzania dializy po przeszczepieniu wątroby/wątroby-nerki i nie było zwyczaju monitorowania poziomu szczawianów w osoczu po przeszczepieniu.

Sytuacja uległa zmianie po zatwierdzeniu nowego leku. Lumisiren trafił do koszyka zdrowotnego w Izraelu w 2022 roku dla wszystkich pacjentów z PH1. Leczenie zastępuje przeszczep wątroby, w związku z czym istnieje konieczność monitorowania stężenia szczawianów w osoczu w następujących sytuacjach:

1. Do monitorowania odpowiedzi na leczenie lumsirenem u pacjenta dializowanego, który nie oddaje moczu (dlatego nie jest możliwe monitorowanie zmniejszenia stężenia szczawianów w moczu)
2. W przygotowaniu do przeszczepienia nerki u pacjenta PH1 z zaawansowaną niewydolnością nerek leczonego lumsiranem. Zgodnie z najnowszymi zaleceniami przed przeszczepieniem nerki należy poczekać do spadku stężenia szczawianów w osoczu do wartości poniżej 70 mikromoli/litr
3. Po przeszczepieniu nerki u pacjenta leczonego lumesirenem, w celu oceny ryzyka i konieczności dializy po przeszczepieniu w celu ochrony nerek, jeśli występuje duże stężenie szczawianów w osoczu.

Badanie szczawianu w osoczu nie jest proste w porównaniu z badaniem jego poziomu w moczu, ponieważ wartości w moczu są o rząd wielkości wyższe niż w osoczu (w moczu w mmol/litr i w osoczu mikromol/litr) i dostępne na rynku testy są bardziej wrażliwe przy wyższych stężeniach. Ponadto szczawian jest niestabilny: w stosunkowo zasadowym środowisku (4pH>) następuje przemiana kwasu askorbinowego w szczawian, dlatego na etapie przygotowania testu wymagane jest zakwaszenie osocza.

Zestaw do badania szczawianów w moczu w naszym laboratorium biochemicznym, oparty na enzymie oksydazie szczawianowej i reakcji barwnej (kulometrycznej), został zakupiony w firmie Biotech Trinity. Zgodnie z instrukcją producenta zestaw przeznaczony jest do badania poziomu szczawianów w moczu. Test ten wykonywany jest w naszym laboratorium i przeszedł wewnętrzną walidację zgodnie z instrukcjami producenta.

W laboratoriach na świecie istnieją dwa rodzaje badań poziomu szczawianów w osoczu – laboratoria stosujące test enzymatyczny oparty na zestawie TRINITY BIOTECH i spektrofotometrii oraz laboratoria stosujące metodę spektrometrii mas (gazowej lub jonowej).

Druga metoda (spektrometria mas) jest uważana za dokładną dla szczawianów w osoczu, ale jest dość kosztowna i niedostępna dla naszego laboratorium. Zastosowanie enzymu oksydazy szczawianowej jest akceptowane w badaniach i dla potrzeb klinicznych w wiodących laboratoriach na świecie.

W laboratorium biochemicznym szpitala uniwersyteckiego CHARITE w Berlinie szeroko wykorzystuje się testy szczawianowe w osoczu do celów klinicznych i badawczych. Laboratorium i Oddział Nefrologii Szpitala CHARITE uznawane są za światowych liderów w dziedzinie hiperoksalurii i publikowały badania, w których oznaczano poziom szczawianu w osoczu metodą enzymatyczną w zestawie TRINITY.

Biorąc pod uwagę konieczność wykonywania badania osocza szczawianowego w Izraelu oraz bycie wiodącym ośrodkiem w dziedzinie hiperoksalurii w Izraelu, badacze są zainteresowani umieszczeniem testu w laboratorium biochemicznym naszej instytucji. Zgodnie ze środkami, którymi dysponuje laboratorium tutaj oraz po zbadaniu efektywności i wiarygodności testu enzymatycznego opartego na oksydazie szczawianowej, badacze postanowili zwalidować test osocza szczawianowego w naszym laboratorium. Ponieważ producent wyznacza zestaw wyłącznie do badania moczu, nie jest możliwe przeprowadzenie walidacji w oparciu o zestawy testowe producenta, a badacze potrzebowali walidacji zewnętrznej. W dotychczas przeprowadzonych badaniach pilotażowych badacze uzyskali wartości akceptowalne w zależności od stanu klinicznego pacjenta.

Prof. Knopf ze szpitala CHARITE w Berlinie hojnie zgodził się na wykonanie dla nas zewnętrznej walidacji testu szczawianu w osoczu, wykonywanego w naszym laboratorium biochemicznym.

Metody:

Liczba próbek: łącznie zostanie pobranych 30 próbek krwi od 30 różnych pacjentów. Próbki zostaną pobrane od różnych pacjentów w celu uzyskania szerokiego zakresu poziomów szczawianów w osoczu. Pobrane zostanie około 10 próbek od zdrowych ochotników, około 10 próbek od pacjentów dializowanych bez hiperoksalurii, około 5 próbek od pacjentów z hiperoksalurią leczonych farmakologicznie lub po przeszczepieniu wątroby i około 5 próbek od pacjentów z zaawansowaną niewydolnością nerek niepoddawanych dializie.

Protokół badania - w załączniku. Protokół jest kompatybilny z laboratorium, w którym będzie przeprowadzona walidacja zewnętrzna.

Każda próbka zostanie natychmiast wysterylizowana, a osocze zostanie podzielone na dwie probówki i przechowywane w stanie zamrożonym (-80). Jedna probówka zostanie wysłana do badań w laboratorium w Berlinie, a jedna probówka pozostanie tutaj i zostanie zbadana w naszym laboratorium.

Etap obróbki próbki aż do zamrożenia jest taki sam, jak zostanie tu wykonany.

Proces obsługi próbek w laboratorium będzie wykonywany przez jednego pracownika laboratorium.

Próbki zostaną wysłane zamrożone do laboratorium w Berlinie. Drugi etap – obróbka próbki po rozmrożeniu – zostanie przeprowadzony zgodnie z protokołem uzgodnionym pomiędzy obydwoma laboratoriami, aby uniknąć różnic w traktowaniu próbki. Badacze będą również koordynować dni testów pomiędzy obydwoma laboratoriami, aby uniknąć różnic wynikających z czasu przechowywania próbek w zamrażarce.

Protokół został sporządzony wspólnie przez nas z laboratorium w Berlinie. Wysyłka próbek zostanie sfinansowana przez firmę Medison Pharmaceuticals w ramach wsparcia projektu mającego na celu podnoszenie świadomości i poprawę usług dla pacjentów z hiperoksalurią w Galilei.

Statystyka – po otrzymaniu odpowiedzi testowych z Berlina badacze porównają uzyskane tam i tutaj wyniki, korzystając z następujących testów:

Dane ilościowe zostaną opisane przy użyciu średnich i odchyleń standardowych, mediany, rozstępu międzykwartylowego (IQR) i rozstępu.

Testy porównawcze dla par próbek - w celu zbadania różnic pomiędzy dwiema sparowanymi próbami za pomocą testu T dla par prób (jeśli różnice mają rozkład normalny) lub testu rang ze znakiem Wilcoxona, jeśli rozkład różnic nie jest normalny. Dla różnicy między sparowanymi próbkami zostanie obliczony 95% przedział ufności.

Testy korelacji - w celu sprawdzenia związku pomiędzy sparowanymi próbkami. Test współczynnika korelacji Pearsona lub alternatywnie test współczynnika korelacji Spearmana (zostanie wybrany w zależności od wielkości próby i kształtu rozkładu). Do wykazania różnicy pomiędzy wynikami wykorzystano wykres Blanda-Altmana i krzywe punktowe.

Wartość P niższa niż 5% będzie uważana za istotną statystycznie.

Zachowanie anonimowości: próbki zostaną oznaczone podanym tutaj kodem, bez szczegółów identyfikujących na formularzach lub probówkach. Tabela kodowania będzie przechowywana oddzielnie na komputerze głównego badacza oraz w osobnym segregatorze w szafie koordynatora badania.

Świadoma zgoda: Wolontariusze podpiszą formularz świadomej zgody po wyjaśnieniu znaczenia testu.