Validační test na hladinu oxalátu v plazmě v biochemické laboratoři v Galilee Medical Center

Zdrojem oxalátu v těle je endogenní produkce v játrech a výživa. Oxalát se vylučuje močí ledvinami. V situacích, kdy je v moči nadbytek oxalátu, může krystalizovat spolu s vápníkem a usadit se jako krystaly šťavelanu vápenatého v ledvinách a způsobit poškození ledvin. Pokud dojde k pokročilému poškození ledvin, je narušena sekrece šťavelanu v moči a šťavelan se hromadí v krvi a ukládá se ve všech tkáních těla, včetně očí, kostí, kostní dřeně, cév a dalších. Stavy, kdy je v těle vysoká hladina oxalátu, jsou způsobeny otravou (etylenglykol) nebo stavy sekundární hyperoxalurie, jako je cystická fibróza nebo zánětlivá střevní onemocnění (v případě tukového průjmu dochází ke zvýšené absorpci šťavelanu ve střevě ) nebo u primární hyperoxalurie.

Primární hyperoxalurie je skupina onemocnění způsobených zvýšeným vylučováním oxalátu játry, v důsledku genetického defektu v metabolické dráze oxalátů v játrech. Hyperoxalurie typu 1 (PH1) je nejzávažnější z celé skupiny a způsobuje selhání ledvin u většiny pacientů ve druhé dekádě života. Léčba PH1 byla donedávna založena na transplantaci jater za účelem obnovení normálního enzymu a ve většině případů byla nutná i transplantace ledviny. V listopadu 2021 schválil FDA průlomový lék na hyperoxalurii, LUMASIRAN.

Pediatrická nefrologická jednotka v Galilee Medical Center je specializovaným centrem pro hyperoxalurii. Výskyt onemocnění v populaci v Galileji je jeden z nejvyšších na světě a díky tomu bylo nashromážděno mnoho zkušeností s léčbou onemocnění v našem centru.

Také dětská nefrologická jednotka byla využívána jako centrum klinického výzkumu společnosti ALNYLAM k testování účinnosti a bezpečnosti léku LUMASIRAN. Nyní je osm pacientů s PH1, kteří dostávají nový lék (prostřednictvím výzkumu nebo prostřednictvím zdravotnického koše), kteří jsou sledováni na dětské nefrologické jednotce našeho ústavu.

Vyšetření hladiny oxalátů v plazmě je vyžadováno především u pacientů s hyperoxalurií, především za účelem sledování odpovědi na léčbu nebo při přípravě na rozhodnutí o transplantaci ledviny. Existují další situace, ve kterých je důležité provést test, jak je uvedeno výše, ale jedná se o vzácnější situace. V Izraeli neexistuje laboratoř, která by testovala hladinu oxalátu v plazmě.

Existuje několik laboratoří, mezi nimi biochemická laboratoř v Galilee Medical Center, které provádějí test hladiny oxalátu v moči. Vyšetření moči se provádí jako vstupní vyšetření v situacích, kdy je podezření na hyperoxalurii, a jako součást vyšetření ledvinových kamenů.

V období před objevením se medikamentózní léčby PH1, kdy definitivní léčba spočívala na transplantaci jater, bylo v Izraeli zvykem sledovat pouze oxalát v moči. V USA a Evropě bylo zvykem po transplantaci jater sledovat hladinu oxalátu v plazmě a při poklesu hladiny na hodnotu blízkou normálu bylo doporučeno přistoupit k transplantaci ledviny. V situacích, kdy byly darovány játra a ledviny od zemřelého, nebylo přijatelné odkládat transplantaci ledviny a existovala centra, která prováděla dialýzu po určitou dobu po transplantaci jater a ledvin při sledování hladin oxalátů v plazmě V Izraeli, as uvedeno, nebylo obvyklé provádět dialýzu po transplantaci jater/játra-ledviny a nebylo zvykem monitorovat hladiny oxalátů v plazmě po transplantaci.

Situace se změnila po schválení nové medikamentózní léčby. Lumisiren vstoupil do zdravotního koše v Izraeli v roce 2022 pro všechny pacienty s PH1. Léčba nahrazuje transplantaci jater a v důsledku toho je potřeba monitorovat hladiny oxalátů v plazmě v následujících situacích:

1. Ke sledování odpovědi na léčbu lumsirenem u dialyzovaného pacienta, který nemočí (není tedy možné sledovat pokles oxalátu v moči)
2. V rámci přípravy na transplantaci ledviny u pacienta s PH1 s pokročilým selháním ledvin, který je léčen lumsiranem. Podle posledních doporučení je nutné před transplantací ledviny počkat na pokles oxalátu v plazmě na hodnotu nižší než 70 mikromol/l
3. Po transplantaci ledviny u pacienta léčeného lumesirenem za účelem posouzení rizika a nutnosti dialýzy po transplantaci za účelem ochrany ledviny, pokud jsou v plazmě vysoké hladiny oxalátu.

Vyšetření oxalátu v plazmě není jednoduché ve srovnání s vyšetřením hladiny v moči, protože hodnoty v moči jsou řádově vyšší než v plazmě (v moči hodnoty mmol/litr a v plazmě mikromol/litr) a testy dostupné na trhu jsou citlivější při vyšších koncentracích. Šťavelan je navíc nestabilní: v relativně zásaditém prostředí (4pH>) dochází k přechodu kyseliny askorbové na šťavelan, a proto je během přípravné fáze testu nutné okyselení plazmy.

Souprava používaná k testování oxalátu v moči v naší biochemické laboratoři je založena na enzymu oxalátoxidáze a barevné reakci (coulometrické) a byla zakoupena od Biotech Trinity. Dle návodu výrobce je souprava určena pro testování hladiny oxalátů v moči. Tento test se provádí v naší laboratoři a prošel interní validací podle pokynů výrobce.

Ve světě existují dva typy testů na hladinu oxalátů v plazmě v laboratořích - Existují laboratoře, které používají enzymatický test založený na soupravě TRINITY BIOTECH a spektrofotometrii a jsou laboratoře, které používají metodu hmotnostní spektrometrie (plyn nebo ionty).

Druhá metoda (hmotnostní spektrometrie) je považována za přesnou pro oxalát v plazmě, ale je poměrně drahá a není dostupná pro naši laboratoř. Použití enzymu oxalátoxidázy je akceptováno ve výzkumu a pro klinické potřeby v předních laboratořích na světě.

V biochemické laboratoři v univerzitní nemocnici CHARITE v Berlíně jsou široce používány oxalátové testy v plazmě pro klinické a výzkumné účely. Nefrologická laboratoř a oddělení v nemocnici CHARITE jsou považovány za světové lídry v oblasti hyperoxalurie a publikované studie, kde byl plazmatický oxalát měřen enzymatickou metodou v soupravě TRINITY.

Vzhledem k potřebě provést test oxalátové plazmy v Izraeli a vzhledem k tomu, že jsme předním centrem v oblasti hyperoxalurie v Izraeli, mají vyšetřovatelé zájem o umístění testu v biochemické laboratoři naší instituce. V souladu s prostředky, které má laboratoř k dispozici, a po otestování účinnosti a spolehlivosti enzymatického testu na bázi oxalátoxidázy se vyšetřovatelé rozhodli validovat oxalátový plazmatický test v naší laboratoři. Protože výrobce určuje soupravu pouze pro testování moči, není možné provést validaci na základě testovacích souprav výrobce a výzkumníci potřebovali externí validaci. V dosud probíhajících pilotních testech vyšetřovatelé obdrželi přijatelné hodnoty podle klinického stavu pacienta.

Prof. Knopf z nemocnice CHARITE v Berlíně velkoryse souhlasil s provedením externí validace pro plazmatický oxalátový test provedený v naší biochemické laboratoři.

Metody:

Počet odběrů: celkem bude odebráno 30 vzorků krve, od 30 různých pacientů. Vzorky budou odebrány od různých pacientů, aby se získalo široké rozmezí hladin oxalátu v plazmě. Bude odebráno asi 10 vzorků od zdravých dobrovolníků, asi 10 vzorků od dialyzovaných pacientů bez pozadí hyperoxalurie, asi 5 vzorků od pacientů s hyperoxalurií, kteří jsou léčeni léky nebo po transplantaci jater, a asi 5 vzorků od pacientů s pokročilým selháním ledvin, kteří nejsou na dialýze.

Zkušební protokol - přiložen v příloze. Protokol je kompatibilní s laboratoří, kde bude externí validace provedena.

Každý vzorek bude okamžitě sterilizován a plazma bude rozdělena do dvou zkumavek a uchovávána ve zmrazeném stavu (-80). Jedna zkumavka bude odeslána k testování do laboratoře v Berlíně a jedna zkumavka zde zůstane a bude testována v naší laboratoři.

Krok ošetření vzorku až do zmrazení je stejný jako zde.

Proces manipulace se vzorky v laboratoři zde bude provádět jeden pracovník laboratoře.

Vzorky budou zaslány zmrazené do laboratoře v Berlíně. Druhý krok – úprava vzorku po rozmrazení – bude proveden podle protokolu dohodnutého mezi oběma laboratořemi, aby se předešlo rozdílům v zacházení se vzorkem. Vyšetřovatelé budou také koordinovat dny testů mezi dvěma laboratořemi, aby se předešlo rozdílům vyplývajícím z doby uchovávání vzorků v mrazáku.

Protokol jsme sepsali společně s laboratoří v Berlíně. Zásilku vzorků bude financovat společnost Medison Pharmaceuticals jako součást podpory projektu na zvýšení povědomí a zlepšení služeb pro pacienty s hyperoxalurií v Galilei.

Statistika - po obdržení odpovědí testu z Berlína vyšetřovatelé porovnají výsledky získané tam a zde pomocí následujících testů:

Kvantitativní data budou popsána pomocí průměrů a směrodatných odchylek, mediánu, mezikvartilového rozmezí (IQR) a rozmezí.

Srovnávací testy pro párové vzorky - ke zkoumání rozdílů mezi dvěma párovými vzorky pomocí párového T testu (jsou-li rozdíly normálně rozděleny) nebo Wilcoxonovým znaménkovým testem, pokud rozložení rozdílů není normální. Pro rozdíl mezi spárovanými vzorky bude vypočítán 95% interval spolehlivosti.

Korelační testy – pro testování vztahu mezi spárovanými vzorky. K prokázání rozdílu mezi výsledky byly použity Pearsonův test korelačního koeficientu nebo alternativně Spearmanův test korelačního koeficientu (bude zvolen podle velikosti vzorku a tvaru distribuce) Bland-Altmanův graf a křivky Scatter plot.

Hodnota P nižší než 5 % bude považována za statisticky významnou.

Zachování anonymity: vzorky budou označeny zde uvedeným kódem, bez identifikačních údajů na formulářích nebo zkumavkách. Kódovací tabulka bude uložena odděleně na počítači hlavního výzkumníka a v samostatném pořadači ve skříni koordinátora výzkumu.

Informovaný souhlas: Dobrovolníci po vysvětlení významu testu podepíší formulář informovaného souhlasu.