「乳がん患者における主要なエピジェネティックメディエーターの役割の研究」

乳がんは、世界中の女性で最も頻度の高い悪性腫瘍の 1 つであり、世界の女性の主な死因の 1 つであると考えられています。 診断と治療が目覚ましい進歩を遂げたにもかかわらず、乳がん患者の予後は依然として期待外れである[1][2]。 乳がんは非常に不均一な疾患であり、エストロゲン受容体 ER、プロゲステロン受容体 PR、ヒト上皮成長因子受容体 HER2 などの特定のホルモン受容体の発現に基づいて 4 つのサブタイプに分類されます[2]。 以下は乳がんの 4 つのサブタイプです: Luminal A 腫瘍は ER および/または PR の存在と HER2 の非存在を特徴とします。Luminal B 腫瘍は Luminal A と比較して悪性度が高く、予後が悪く、ER 陽性であり、 PR 陰性で Ki67 の発現が高く (20% 以上)、HER2 陽性グループは乳がんの 10 ～ 15% を占め、以下の特徴があります。 ER および PR が存在しない HER2 発現、および以前の 3 つの受容体の発現が欠如しているトリプルネガティブ乳がん [3][4]。

遺伝子発現のエピジェネティクス制御とは、ヌクレオチド配列を変更せずに遺伝子発現機能を変化させることです。 がん関連遺伝子の活性化と不活性化はどちらも、エピジェネティックなメカニズムによって発生する可能性があります。 遺伝子調節のエピジェネティックな機構における主な役割は、DNA メチル化、ヒストン修飾、クロマチン リモデラー、およびノンコーディング RNA 発現です [5]。

ヒストン修飾はクロマチン構造の重要な調節因子の 1 つであり、転写調節因子に対する DNA のアクセス可能性を定義し、遺伝子発現に影響を与え、重要な細胞プロセスに影響を与えるため、遺伝子発現にとって非常に重要です [6]。

ヒストン修飾は転写因子、クロマチンリモデラー、クロマチン構造タンパク質を動員することができるため、活性または抑制的なクロマチン状態の形成と維持に寄与します[6]。 最も重要なヒストン修飾は、リジンのアセチル化、リジンおよびアルギニンのメチル化、セリン/スレオニン/チロシンのリン酸化、およびセリン/スレオニンのユビキチン化です[6]。 ヒストン修飾酵素の多くは、さまざまな種類のがんで頻繁に変異しています。例として、EHMT2 (G9A) はヒストン H3 のリジン残基をメチル化するメチルトランスフェラーゼをコードしています。このタンパク質による H3 のリジン 9 のメチル化により、追加のエピジェネティックな調節因子が動員され、ヒストン H3 のリジン残基がメチル化され、ヒストン H3 のリジン残基がメチル化され、転写。 ヒストンメチルトランスフェラーゼ G9a の腫瘍増殖への関与については十分に文書化されています [7]。 ヒストン修飾酵素の別の例は、抑制マークである H4k20me マークの沈着を触媒するメチルトランスフェラーゼ酵素である KMT5B (SUV420H1) であり、多くの種類の癌において腫瘍抑制因子の役割があると考えられています [8]。

クロマチン構造は、クロマチンリモデラー複合体によっても制御されます。これらは、哺乳類における ATP 依存性クロマチンリモデラーの 4 つの保存されたファミリー (CHD)、(ISWI)、(INO80)、および (SWI/SNF) であり、ほとんどの機能に関与しています。必須の細胞プロセス[9]。

クロマチン修飾機構は、乳がんを含むがんにおいて高度に調節不全となっている。例として、SWI/SNF複合体のサブユニットをコードする遺伝子の変異または不活化ががんの約20％で見られる[10]。

もう 1 つの重要なエピジェネティック メカニズムは、遺伝子発現に対する非コード RNA の影響です。

ノンコーディング RNA (ncRNA) は、タンパク質に翻訳されない不均一な転写産物のグループです。 それらは複数の生物学的機能の重要な調節因子として浮上しており、その調節不全は癌を含む疾患に関与していると考えられています。 これらは疾患のバイオマーカーとして使用されるため、科学界で大きな関心を集めています。 miRNA や lncRNA など、ncRNA には多くの種類があります [11]。

マイクロRNA (miRNA) は、遺伝子発現の制御に関与する小さく、高度に保存された非コーディング RNA 分子 (18 ～ 25) ヌクレオチドです。 蓄積された研究により、マイクロRNA (miRNA) が腫瘍の進行において腫瘍抑制因子またはがん遺伝子として作用する新規な調節因子であることが特定されています[12]。 エキソソーム miR-138-5p は、KDM6B タンパク質の阻害を介して乳がん患者において発癌機能を発揮することが報告されています [13]。 Peng Bian MD らは、隣接する組織と比較した場合、乳がん組織では miR-4306 の発現が下方制御されていると報告しました [14]。

長いノンコーディング RNA (lncRNA) は、長さが 200 ヌクレオチドを超える別の種類のノンコーディング RNA であり、そのほとんどはタンパク質に翻訳されません [15]。 ほとんどの lncRNA は翻訳されないという事実にもかかわらず、他の標的遺伝子の遺伝子発現に対する制御機能により、lncRNA は研究において大きな関心を集めています[15]。 LncRNA は、mRNA、DNA、タンパク質、miRNA と相互作用することにより、エピジェネティック、転写、転写後、翻訳、および翻訳後のレベルで遺伝子発現を制御します [16]。 さらに、それらはヒストン修飾、クロマチンリモデリング、転写干渉、転写活性化、mRNA翻訳、RNAプロセシングなどの生物学的プロセスの維持において重要な役割を果たしています[16]。 最近、lncRNA は肺がん、肝臓がん、前立腺がん、膀胱がん、乳がんなどの多くのがんに関与していることが述べられ[2]、そのため、lncRNA はがん治療における新規バイオマーカーおよび薬学的標的として使用できる可能性があります[17]。 たとえば、発がん性 lncRNA PVT1 は、miR-181a-2-3p/ESR1 軸を介して乳がん細胞の増殖を促進します [18]。 重要なことは、lncRNA はクロマチン修飾およびリモデリング複合体とクロストークして、発がん性経路だけでなく多くの正常な細胞経路を厳密に制御する可能性があることです。 これらは、直接的な相互作用によって、または特定の miRNA のスポンジングを介して間接的に、クロマチン修飾機構を制御できます。 癌における直接相互作用の例：LncRNA UCA1はSMARCA4との結合を介してクロマチンリモデリングを制御し、膀胱癌の増殖を引き起こすp21プロモーター上のその領域への結合を損なう[19]。 癌における間接的相互作用の例: LncRNA-MIAT は甲状腺癌の進行を促進し、miR-150-5p をスポンジングすることによって EZH2 を標的とする ceRNA として機能します [20]。

LncRNA は血漿/血清中で検出できるため、非侵襲性バイオマーカーとして機能します [21]。

LncRNA UPK1A-AS1 は、新たに同定されたがんのバイオマーカーです。 二本鎖切断修復を介してプラチナ耐性を付与することにより、膵臓がんにおいて発がん性の役割を果たしていることが報告されています[22]。 さらに、UPK1A-AS1 は EZH2 と相互作用することによって HCC の増殖を促進すると述べられています [23]。 lncRNA UPK1A-AS1はHCC、膵臓がん、肺がん細胞株において発がん性があると報告されているという事実にもかかわらず、スポンジングmiR-1248を介して食道扁平上皮がん細胞がんにおいて腫瘍抑制因子の役割を果たしていると考えられていた[24][ 25]。

LncRNA UNC5B-AS1 は、甲状腺がん、前立腺がん、HCC におけるがん遺伝子として認識されています [26] [27]。 また、ヒストン修飾の調節を介して卵巣がんにおいて発がん性の役割を果たしているとも述べられています[28]。

しかし、乳がん患者の病因における lncRNA UPK1A-AS1 および UNC5B-AS1 の役割はまだ明らかにされていません。

1.2. 問題の定義。 エジプトでは、乳がんは女性の間で最も一般的な悪性腫瘍であり、ほとんどの症例は後期段階で診断され、予後不良である[29]。 2050 年には約 46,000 件の事件が発生すると予測されています。 エジプトの罹患率は世界の数字よりも低いですが、先進国と比較すると死亡率は約2倍(41%対23%)はるかに高くなっています[30]。 したがって、乳がんの診断および/または予後のための新規マーカーを提供すること、ならびにそれらの発がんとの関連の根底にある分子機構を理解することは、乳がんの管理および治療における課題のままである。

1.3. 仮説。 問題提起は、この進行性の疾患の診断と予後を助けるために、これまで乳がん患者で研究されたことのない新規マーカーを提供することです。 したがって、本研究では、乳がんにおける診断および/または予後マーカーの可能性としての長い非コーディング RNA UPK1A-AS1 および/または UNC5B-AS1 の役割を調査します。 さらに、mir-138-5p および mir-4306 などの特定の標的 miRNA のスポンジングを介した、これらの長い非コード RNA とクロマチン修飾酵素および/または KMT5B および G9A などのリモデリング複合体との間のクロストークおよび相関関係の可能性が調査されます。 2. これまでの研究結果 2.1. 張ら。 UPK1A-AS1 は、EZH2 との相互作用および miR-138-5p のスポンジングを通じて細胞周期の進行を加速することにより、HCC の発生を促進することを報告しました[23]。

2.2. 王ら。 UNC5B-AS1 は、EZH2 を介して NDRG2 上の H3K27me を制御することにより、卵巣がんの進行を促進することを報告しました[28]。

2.3. ハウアンら。 UNC5B-AS1 は、miR-4306/KDM2A 軸の制御を介して肝細胞癌細胞の増殖、遊走、および EMT を促進することを報告しました[26]。

3. 研究の目的 候補 lncRNA UPK1A-AS1 および/または UNC5B-AS1 の発現レベルを推定し、それを乳がん患者のさまざまな臨床パラメータと相関させ、クロマチン修飾タンパク質および/またはリモデリングタンパク質とのクロストークの可能性を解明することmir-138-5p および mir-138-5p としての特定の標的 miRNA のスポンジングを介した乳がん患者における KMT5B および G9A としてミル-4306。

4. 研究目的 4.1. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応技術 (qRT-PCR) を使用して、乳がん患者からの血清サンプル (リキッドバイオプシー) および/または組織サンプル中の lncRNA UPK1A-AS1 および/または UNC5B-AS1 およびその標的 miRNA 遺伝子発現を測定します。

4.2. ELISA により、血清および/または組織の標的タンパク質レベルを測定します。 4.3. これらの ncRNA 発現レベルを古典的なタンパク質腫瘍マーカーと比較します (4.4)。 これらの ncRNA と標的タンパク質レベル軸を、腫瘍の病期および悪性度、腫瘍進行 (TNM)、および癌胎児性抗原 (CEA)、癌抗原 15-3 (CA15-3 など) などの他の古典的な臨床病理学的予後バイオマーカーとしての乳癌の臨床病理学的特徴と相関させます。 )、(ER)、(PR)、ヒト上皮成長因子受容体 2 (HER2/neu)、増殖マーカーKi-67 または PCNA、全血球計算 (CBC)、BMI、BP、血糖値、インスリン。

5. 研究成果 5.1. 主要な。 乳がん患者のリキッドバイオプシーや組織サンプルから得られた候補 lncRNA とその下流ターゲットの役割を解明します。

5.2. 出版物/可視化の結果。 レビュー記事 + 見つかった結果を取り上げた Scopus Q1 国際出版物 1 冊 + 評判の高い国際会議での調査結果の発表。

6. 研究の意義 6.1. 私たちの知る限り、これは乳がんの臨床サンプルにおける UPK1A-AS1 および/または UNC5B-AS1 の発現レベルを測定した最初の研究成果です。

6.2. これらのデータは、乳がんの診断と予後を助け、遺伝子治療の潜在的な標的となる新規マーカーを導入する際の有望なアプローチを提供する可能性がある。

7. 研究方法 7.1. バイオインフォマティクス分析 7.1.1. The Cancer Genome Atlas データ（TCGA）のデータに基づく遺伝子発現プロファイリングインタラクティブ分析（GEPIA）により、乳がんサンプルにおける候補 lncRNA の発現を調査します。

7.1.2. バイオインフォマティクス ツールおよび/またはオンライン ソフトウェア miRcode (http://mircode.org/index.php) を使用した実験研究による標的 miRNA の調査。

7.1.3. miRNA オンライン ツールを介して、選択した miRNA 標的遺伝子を調査: miRDB https://mirdb.org/index.html、 starBase または ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ ターゲット スキャン: https://www.targetscan.org/vert_80/。

7.1.4. エンリッチャーデータベースを介したターゲット遺伝子リストのパスウェイ分析またはジーンオントロジーにより、ターゲット遺伝子リストはクロマチン修飾および/またはリモデリングタンパク質との関係について分析されました。

8. 倫理的声明 8.1.1。 この研究は、1964年に初版が発行され、2013年と2018年10月に改訂された、ヒトを対象とした医学研究に関する世界医師会（WMA）の倫理ガイドラインを参照し、ヘルシンキ宣言によって設定されたガイドラインに従って実施されます。 (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/)。

サンプルは、参加者の発表とインフォームドコンセントへの署名後に収集されます。

8.1.2. 参加するための倫理的な承認と同意。 この研究は、アインシャムス大学薬学部の研究倫理委員会 (REC) によって最初に承認されました。 9. サンプルサイズと研究の力 9.1. 推定サンプル サイズは、G power* サンプル サイズ オンライン計算ツール http://www.gpower.hhu.de/en.html によって計算されました。 次の入力データを使用します。α 誤り確率は (0.05)、学習の検出力 (0.8) です。 Bian et al、2021 ;Huang et al、2021;によって実施された以前の研究に基づいています。 Tan et al、2020; Madhvan et al、2014 [31] [12] [24] [25] では、中程度から高い効果サイズが示されており、サンプル サイズを計算するために中程度の効果サイズ (0.5) が選択されました。

サンプルの合計サイズは 102 件となり、この数は 50:50 の比率または 60:40 の比率で 2 つのグループに分割されます。

9.2. 研究デザイン。 症例対照、後ろ向き、単一施設研究。 9.3. 研究参加者。 エジプトのカイロにあるアイン・シャムス大学臨床腫瘍科乳がん部門から、一連のエジプト人女性乳がん患者が募集される。

グループ1;悪性非転移性乳がん患者。新たに乳がんと診断された患者。

グループ2;対照群。健康なボランティア。 9.3.1臨床病理学的 基準。 医療記録および元の病理学報告書から得られた臨床データ。 これらのデータは詳細な Excel ファイルにまとめられます。

以下の臨床データは、添付の Excel ファイルのように記録および評価されます。

• すべての乳がん参加者について、完全な家族歴が記録されます。
• 個々のがんの病歴と腫瘍の臨床評価は、米国がん合同委員会 (AJCC) の (TNM) 分類を使用して行われます。
• ブルーム-リチャードソンスケールは組織学的等級付けに使用されます。
• 肥満指数（BMI）、CBC、閉経状態、乳がんの組織病理学的タイプに関する乳がん患者の特徴。浸潤性乳管癌 (IDC) および浸潤性小葉癌 (ILC)。 乳がんの分子分類はルミナル A、B、トリプルネガティブ乳がんです。
• 腫瘍サイズ、臨床病理学的バイオマーカー CEA、CA15-3、ER、PR、Her2/neu、Ki-67 または PCNA (存在する場合) データは、さらなる相関関係と統計分析のために患者ファイルから収集されます。

9.3.2. 包含基準;新たに乳がんと診断された18歳以上のエジプト女性乳がん患者。

9.3.3 除外基準;血液疾患、乳がん以外のがん、肝硬変、子宮および膀胱疾患、または遠隔転移の証拠のある乳がん患者。

9.4. 血液サンプリング: 6 ml の末梢血を、凝固活性化剤 (Greiner Bio-One GmbH、オーストラリア) を含むポリマーゲルバキュテナーに収集し、15 分間放置します。 室温で凝固させ、その後 10 分間放置します。 4℃、10,000gで遠心分離し、得られた血清を5本の清潔なエッペンドルフチューブに小分けし、アインシャムス大学薬学部生化学部での生化学的評価まで-80℃で保存します。

9.4.1 保存された血清は、製造者の指示に従って市販の ELISA キットを使用して、標的タンパク質レベルの ELISA 技術測定に使用されます。

9.4.2. ゲノム RNA が抽出されます。血清サンプルからの ncRNA の抽出と精製評価。 ステップ 1 プラスによる qRT-PCR を使用した ncRNA 発現レベルの定量化。 miRNeasy Mini Kitを使用して血清サンプルからtotal RNA抽出を進めます。 その後、VERSO c-DNA 合成キット (Thermo Scientific、米国) を使用して c-DNA 合成を行います。

次に、sybr green PCR マスターミックス (Thermo Scientific、米国) と、ターゲット ncRNA およびハウスキーピング参照遺伝子用に設計された特異的プライマーを使用して、定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR) 分析を実行します。

10. 統計分析 10.1. データが収集され、Excel で表化されます。10.2。 SPSS IMB USA (SPSS、イリノイ州シカゴ) バージョン 20 は、Figure 10.3 用のプログラムまたは Stat4 または Graphpad Prism として使用されます。 データは Shapiro-Wilk 計算機 10.3.1 によって正規性についてテストされます。 正規分布変数は平均値 + (S.E.M) として表され、2 つのサンプルを使用して分析されます。正規分布している場合、独立した学生の t 検定と ANOVA はそれぞれ 2 つ以上のグループの比較に使用されます。

10.3.2. 年齢およびＢＭＩなどの交絡因子の調整および正規化、対照と患者の間、ならびに交絡因子を予測するための重回帰分析またはＡＮＣＯＶＡ、１０．３．３。 データは中央値 (範囲) として表示されますが、正規分布していない場合は、マン-ホイットニー (U) またはクラスカル-ウォリス (H) を使用して、それぞれ 2 つ以上の独立したグループ間を比較します。10.4。 P 値は両側であり、P <0.05.11 の場合に有意であると見なされます。