"유방암 환자의 주요 후성유전적 매개체의 역할 연구"

유방암은 전 세계적으로 여성에게 가장 흔한 악성 종양 중 하나로 간주되며 전 세계적으로 여성의 주요 사망 원인 중 하나로 간주됩니다. 진단과 치료법의 눈부신 발전에도 불구하고 유방암 환자의 예후는 여전히 실망스럽습니다[1][2]. 유방암은 에스트로겐 수용체 ER, 프로게스테론 수용체 PR 및 인간 표피 성장 인자 수용체 HER2와 같은 특정 호르몬 수용체의 발현을 기반으로 4가지 하위 유형으로 분류되는 매우 이질적인 질병입니다. 다음은 유방암의 네 가지 하위 유형입니다. Luminal A 종양은 ER 및/또는 PR이 있고 HER2가 없는 것이 특징입니다. Luminal B 종양은 Luminal A에 비해 등급이 더 높고 예후가 더 나쁩니다. 이들은 ER 양성이고 ER 양성입니다. PR 음성일 수 있고 Ki67의 높은 발현(20% 이상)을 가질 수 있으며, HER2 양성 그룹은 유방암의 10-15%를 구성하고 높은 HER2를 특징으로 합니다. ER 및 PR이 없는 발현 및 이전 세 가지 수용체의 발현이 부족한 삼중 음성 유방암[3][4].

유전자 발현의 후성유전학 조절은 뉴클레오티드 서열을 변경하지 않고 유전자 발현 기능을 변경하는 것입니다. 암 관련 유전자의 활성화와 비활성화는 모두 후생적 메커니즘에 의해 발생할 수 있습니다. 유전자 조절의 후생적 메커니즘의 주요 역할은 DNA 메틸화, 히스톤 변형, 염색질 리모델링, 비암호화 RNA 발현입니다.

히스톤 변형은 전사 조절자에 대한 DNA의 접근성을 정의하고 유전자 발현에 영향을 미치며 중요한 세포 과정에 영향을 주기 때문에 유전자 발현에 매우 중요한 염색질 구조의 중요한 조절자 중 하나입니다[6].

히스톤 변형은 전사 인자, 염색질 리모델러 및 염색질 구조 단백질을 모집할 수 있으므로 활성 또는 억제 염색질 상태의 형성 및 유지에 기여합니다[6]. 가장 중요한 히스톤 변형은 라이신 아세틸화, 라이신 및 아르기닌 메틸화, 세린/트레오닌/티로신 인산화 및 세린/트레오닌 유비퀴틸화입니다[6]. 많은 히스톤 변형 효소는 다양한 유형의 암에서 자주 돌연변이가 발생합니다. 예: EHMT2(G9A)는 히스톤 H3의 라이신 잔기를 메틸화하는 메틸트랜스퍼라제를 암호화합니다. 이 단백질에 의해 라이신 9의 H3가 메틸화되면 추가적인 후성유전적 조절인자가 동원되고 히스톤의 히스톤이 억제됩니다. 전사. 히스톤 메틸트랜스퍼라제 G9a는 종양성 성장에 미치는 영향에 대해 잘 문서화되어 있습니다[7]. 히스톤 변형 효소에 대한 또 다른 예는 억제 표시인 H4k20me 표시의 침착을 촉매하고 많은 암 유형에서 종양 억제 역할을 하는 것으로 여겨지는 메틸 전이 효소인 KMT5B(SUV420H1)입니다.

염색질 구조는 또한 염색질 리모델링 복합체에 의해 조절될 수 있습니다. 이는 포유류(CHD), (ISWI), (INO80) 및 (SWI/SNF)에서 ATP 의존성 염색질 리모델링의 4가지 보존된 계열이며 대부분의 과정에 관여합니다. 필수 세포 과정 [9].

염색질 변형 기계는 유방암을 포함한 암에서 고도로 조절되지 않습니다. SWI/SNF 복합체의 하위 단위를 코딩하는 유전자의 돌연변이 또는 불활성화는 암의 약 20%에서 발견됩니다[10].

또 다른 중요한 후생적 메커니즘은 비암호화 RNA가 유전자 발현에 미치는 영향입니다.

비코딩 RNA(ncRNA)는 단백질로 번역되지 않는 이종 전사체 그룹입니다. 이들은 다양한 생물학적 기능의 중요한 조절자로 등장했으며, 이들의 조절 장애는 암을 포함한 질병과 관련이 있습니다. 이는 질병 바이오마커로 사용되기 때문에 과학계에서 큰 관심을 얻었습니다. miRNA와 lncRNA를 포함하여 다양한 유형의 ncRNA가 있습니다[11].

MicroRNA(miRNA)는 유전자 발현 조절에 관여하는 작고 고도로 보존된 비암호화 RNA 분자(18-25) 뉴클레오티드입니다. 축적된 연구에 따르면 microRNA(miRNA)는 종양 진행에서 종양 억제자 또는 종양 유전자 역할을 하는 새로운 조절자라는 것이 확인되었습니다[12]. 엑소좀 miR-138-5p는 KDM6B 단백질 억제를 통해 유방암 환자에서 발암 기능을 발휘하는 것으로 보고되었습니다. Peng Bian MD 등은 miR-4306의 발현이 인접 조직과 비교했을 때 유방암 조직에서 하향조절되는 것으로 보고되었다고 보고했습니다.

긴 비코딩 RNA(lncRNA)는 길이가 200개 이상의 뉴클레오티드이고 대부분이 단백질로 번역되지 않는 또 다른 유형의 비코딩 RNA입니다. 대부분의 lncRNA는 번역되지 않음에도 불구하고 다른 표적 유전자의 유전자 발현에 대한 조절 기능으로 인해 연구에 큰 관심을 얻었습니다[15]. LncRNA는 mRNA, DNA, 단백질 및 miRNA와 상호작용하여 후생유전적, 전사적, 전사후, 번역 및 번역후 수준에서 유전자 발현을 조절합니다[16]. 또한 히스톤 변형, 염색질 리모델링, 전사 간섭, 전사 활성화, mRNA 번역 및 RNA 처리와 같은 생물학적 과정을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 최근에는 lncRNA가 폐암, 간암, 전립선암, 방광암, 유방암 등 많은 암에 관여한다는 사실이 밝혀져[2] 암 치료에서 새로운 바이오마커 및 약학적 표적으로 활용될 수 있다[17]. 예를 들어, 발암성 lncRNA PVT1은 miR-181a-2-3p/ESR1 축을 통해 유방암 세포의 증식을 촉진합니다. 중요한 것은 lncRNA가 염색질 변형 및 리모델링 복합체와 누화를 통해 많은 정상적인 세포 경로와 발암성 경로를 엄격하게 조절할 수 있다는 것입니다. 그들은 직접적인 상호작용을 통해 또는 특정 miRNA를 스펀징하여 간접적으로 염색질 변형 기계를 조절할 수 있습니다. 암에서의 직접적인 상호작용에 대한 예: LncRNA UCA1은 SMARCA4와의 결합을 통해 염색질 리모델링을 조절하여 방광암 증식을 유발하는 p21 프로모터의 해당 영역에 대한 결합을 손상시킵니다. 암의 간접적 상호작용에 대한 예: LncRNA-MIAT는 갑상선암 진행을 촉진하고 miR-150-5p를 스펀징하여 EZH2를 표적으로 하는 ceRNA 역할을 합니다[20].

LncRNA는 혈장/혈청에서 검출될 수 있으므로 비침습적 바이오마커로 기능합니다[21].

LncRNA UPK1A-AS1은 암에서 새로 확인된 바이오마커입니다. 이중 가닥 절단 복구를 통해 백금 저항성을 부여함으로써 췌장암에서 발암성 역할을 하는 것으로 보고되었습니다[22]. 또한, UPK1A-AS1은 EZH2와 상호작용하여 간세포암종의 증식을 촉진하는 것으로 나타났습니다[23]. lncRNA UPK1A-AS1이 HCC, 췌장암 및 폐암 세포주에서 발암성인 것으로 보고되었음에도 불구하고, 이는 스펀징 miR-1248을 통해 식도 편평 세포 암종 세포 암에서 종양 억제 역할을 하는 것으로 믿어졌습니다. 25].

LncRNA UNC5B-AS1은 갑상선암, 전립선암 및 간세포암종에서 종양유전자로 인식되었습니다[26][27]. 또한 히스톤 변형 조절을 통해 난소암에서 발암성 역할을 하는 것으로 명시되었습니다[28].

그러나 유방암 환자의 발병기전에서 lncRNA UPK1A-AS1과 UNC5B-AS1의 역할은 아직 밝혀지지 않았습니다.

1.2. 문제 정의. 이집트에서 유방암은 여성에게 가장 흔한 악성 종양으로, 대부분의 경우 예후가 좋지 않은 말기에 진단됩니다[29]. 2050년에는 약 46,000건의 사고가 발생할 것으로 예상됩니다. 이집트의 발병률은 세계 수준에 비해 낮지만, 선진국과 비교하면 사망률은 약 2배(41% v 23%)로 훨씬 높다[30]. 따라서 유방암 진단 및/또는 예후를 위한 새로운 마커를 제공하고 발암과의 연관성을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 유방암 관리 및 치료에 있어 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.

1.3. 가설. 문제 설명은 이 공격적인 질병의 진단과 예후를 돕기 위해 이전에 유방암 환자에서 연구되지 않은 새로운 마커를 제공하는 것입니다. 따라서, 본 연구에서 우리는 유방암에서 가능한 진단 및/또는 예후 지표로서 긴 비암호화 RNA인 UPK1A-AS1 및/또는 UNC5B-AS1의 역할을 조사할 것입니다. 또한 mir-138-5p 및 mir-4306과 같은 특정 표적 miRNA를 스펀징하여 이러한 긴 비 코딩 RNA와 염색질 변형 효소 및/또는 KMT5B 및 G9A와 같은 리모델링 복합체 사이의 가능한 누화 및 상관 관계를 조사할 것입니다. 2. 이전 연구 결과 2.1. Zhang et al. UPK1A-AS1은 EZH2와의 상호작용 및 miR-138-5p의 스펀징을 통해 세포 주기 진행을 가속화함으로써 HCC 발달을 촉진한다고 보고되었습니다[23].

2.2. 왕 외. UNC5B-AS1은 EZH2를 통해 NDRG2의 H3K27me를 조절하여 난소암 진행을 촉진한다고 보고했습니다.

2.3. Hauanget al. UNC5B-AS1은 miR-4306/KDM2A 축 조절을 통해 간세포 암종 세포의 증식, 이동 및 EMT를 촉진한다고 보고되었습니다.

3. 연구 목표 후보 lncRNA인 UPK1A-AS1 및/또는 UNC5B-AS1의 발현 수준을 추정하고 이를 유방암 환자의 다양한 임상 매개변수와 연관시키고 염색질 변형 및/또는 리모델링 단백질과의 혼선 가능성을 밝힙니다. mir-138-5p 및 mir-4306과 같은 특정 표적 miRNA를 스펀징하여 유방암 환자의 KMT5B 및 G9A로 사용됩니다.

4. 연구 목적 4.1. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 기술(qRT-PCR)을 사용하여 유방암 환자의 혈청 샘플(액체 생검) 및/또는 조직 샘플에서 lncRNA UPK1A-AS1 및/또는 UNC5B-AS1 및 해당 표적 miRNA 유전자 발현을 측정합니다.

4.2. ELISA로 혈청 및/또는 조직 표적 단백질 수준을 측정합니다. 4.3. 이러한 ncRNA 발현 수준을 고전적인 단백질 종양 마커, 4.4와 비교하십시오. 이러한 ncRNA와 표적 단백질 수준 축을 종양 단계 및 등급, 종양 진행(TNM), 암배아 항원(CEA), 암 항원 15-3(CA15-3)과 같은 기타 고전적인 임상병리학적 예후 바이오마커와 같은 유방암의 임상병리학적 특성과 연관시키십시오. ), (ER), (PR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2/neu), 증식 마커 Ki-67 또는 PCNA 및 전체 혈구 수 (CBC), BMI, 혈압, 혈당 수치 및 인슐린.

5. 연구결과 5.1. 주요한. 유방암 환자의 액체 생검 및/또는 조직 샘플에서 얻은 후보 lncRNA 및 해당 다운스트림 표적의 역할을 설명합니다.

5.2. 출판물/가시성 결과. 검토 기사 + 발견된 결과를 다루는 국제 Scopus Q1 간행물 1개 + 국제적으로 평판이 좋은 컨퍼런스에서 결과 발표.

6. 연구의 중요성 6.1. 우리가 아는 한, 이는 유방암 임상 샘플에서 UPK1A-AS1 및/또는 UNC5B-AS1의 발현 수준을 측정한 최초의 연구 작업입니다.

6.2. 이러한 데이터는 유방암의 진단과 예후에 도움이 되는 새로운 마커를 도입하고 유전자 치료를 위한 잠재적인 표적을 제공하는 유망한 접근 방식을 제공할 수 있습니다.

7. 연구 방법론 7.1. 생물정보학 분석 7.1.1. The Cancer Genome Atlas 데이터(TCGA)의 데이터를 기반으로 한 유전자 발현 프로파일링 대화형 분석(GEPIA)을 통해 유방암 샘플에서 후보 lncRNA 발현을 조사합니다.

7.1.2. 온라인 소프트웨어 miRcode(http://mircode.org/index.php)를 사용하여 생물정보학 도구 및/또는 실험 연구를 통해 표적 miRNA를 조사합니다.

7.1.3. miRNA 온라인 도구를 통해 선택된 miRNA 표적 유전자 조사: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase 또는 ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ 및 대상 스캔: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. 농축 데이터베이스를 통한 표적 유전자 목록에 대한 경로 분석 또는 유전자 온톨로지, 표적 유전자 목록이 염색질 변형 및/또는 리모델링 단백질과의 관계에 대해 분석되었습니다.

8. 윤리강령 8.1.1. 이 연구는 1964년에 처음 출판되고 2013년과 2018년 10월에 개정된 인간 대상 의학 연구에 대한 세계의사협회(WMA)의 윤리 지침을 참조하는 헬싱키 선언에 명시된 지침에 따라 수행됩니다. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

샘플은 참가자가 발표하고 사전 동의에 서명한 후에 수집됩니다.

8.1.2. 윤리적 승인 및 참여 동의. 이 연구는 Ain Shams University 약학부 연구윤리위원회(REC)의 승인을 처음으로 받았습니다. 9. 표본 크기 및 연구의 힘 9.1. 추정 표본 크기는 G power* 표본 크기 온라인 계산기(http://www.gpower.hhu.de/en.html)로 계산되었습니다. 다음 입력 데이터를 사용합니다. α 오류 확률은 (0.05), 연구력(0.8)입니다. Bian et al, 2021;Huang et al, 2021; 탄 외, 2020; Madhvan et al, 2014 [31] [12] [24] [25] 중간에서 높은 효과 크기를 보였으며, 표본 크기를 계산하기 위해 중간 효과 크기(0.5)를 선택했습니다.

총 표본 크기는 102개 사례이며, 이 수는 50:50 비율 또는 60:40 비율로 2개의 그룹으로 세분화됩니다.

9.2. 연구 설계. 사례 관리, 회고적, 단일 센터 연구. 9.3. 연구 참가자. 일련의 이집트 여성 유방암 환자들이 이집트 카이로에 있는 아인 샴스 대학(Ain Shams University) 임상 종양학과 유방암 부서에서 모집될 예정입니다.

그룹 1; 악성 비전이성 유방암 환자; 새로 진단된 유방암 환자.

그룹 2; 대조군; 건강한 자원봉사자들. 9.3.1임상-병리학적 기준. 의료 기록 및 원본 병리 보고서에서 얻은 임상 데이터입니다. 이러한 데이터는 상세한 Excel 파일로 컴파일됩니다.

아래의 임상자료를 첨부된 엑셀파일과 같이 기록하고 평가하여야 합니다.

• 모든 유방암 참가자에 대한 전체 가족력이 기록됩니다.
• AJCC(American Joint Committee on Cancer)의 TNM(분류)을 사용하여 개별 암 병력 및 종양 임상 평가를 수행했습니다.
• Bloom-Richardson Scale은 조직학적 등급을 매기는 데 사용됩니다.
• 체질량지수(BMI), CBC, 폐경기 상태, 유방암 조직병리학적 유형에 관한 유방암 환자의 특성; 침윤성 관암종(IDC) 및 침윤성 소엽암종(ILC). 유방암 분자 분류 관강 A, B, 삼중 음성 유방암.
• 종양 크기뿐만 아니라 임상병리학적 바이오마커 CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 또는 PCNA(있는 경우) 데이터는 추가 상관관계 및 통계 분석을 위해 환자 파일에서 수집됩니다.

9.3.2. 포함 기준; 새로 유방암 진단을 받은 18세 이상의 이집트 여성 유방암 환자.

9.3.3 제외 기준; 혈액 질환, 유방암 이외의 모든 암, 간경화, 자궁 및 요로 질환, 원격 전이의 증거가 있는 유방암 환자.

9.4. 혈액 샘플링: 6ml의 말초 혈액을 응고 활성화제(Greiner Bio-One GmbH, Australia)가 포함된 폴리머 겔 진공 용기에 수집하고 15분 동안 방치합니다. 실온에서 응고시킨 후 10분간 방치합니다. 4°C에서 10,000g으로 원심분리하여 얻은 혈청을 5개의 깨끗한 Eppendorf 튜브에 분취하고 Ain-Shams University 약학부 생화학과에서 생화학적 평가가 이루어질 때까지 -80°C에 보관합니다.

9.4.1 저장된 혈청은 제조업체의 지침에 따라 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트를 사용하여 표적 단백질 수준의 ELISA 기술 측정에 사용됩니다.

9.4.2. 게놈 RNA가 추출됩니다. 혈청 샘플로부터 ncRNA 추출 및 정제 평가. ncRNA 발현 수준 정량화, qRT-PCR을 사용하여 1단계 플러스. miRNeasy Mini Kit를 이용하여 혈청 시료로부터 total RNA 추출을 진행해보겠습니다. c-DNA 합성은 이후 VERSO c-DNA 합성 키트(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 수행됩니다.

다음으로, sybr green PCR 마스터 믹스(Thermo Scientific, USA)와 표적 ncRNA 및 하우스키핑 참조 유전자용으로 설계된 특정 프라이머를 사용하여 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 분석을 수행합니다.

10. 통계적 분석 10.1. 데이터가 수집되어 엑셀 표로 작성됩니다. 10.2. SPSS IMB USA(SPSS, Chicago, IL) 버전 20은 그림 10.3의 경우 Stat4 또는 Graphpad Prism이 사용되는 프로그램입니다. 데이터는 Shapiro-Wilk 계산기, 10.3.1을 통해 정규성을 테스트합니다. 정규분포변수는 평균+(S.E.M)로 표현하고 두 개의 표본을 사용하여 분석한다. 독립 학생 t-검정과 ANOVA는 정규분포인 경우 각각 2개 이상의 그룹을 비교하는 데 사용된다.

10.3.2. 연령 및 BMI와 같은 교란변수에 대한 조정 및 정규화, .. 대조군과 환자 간의 교란변수를 예측하기 위한 다중 회귀 분석 또는 ANCOVA, 10.3.3. 정규 분포가 아닌 경우 중앙값(범위)으로 표시되는 데이터는 Mann-Whitney(U) 또는 Kruskal-Wallis(H)를 각각 두 개 이상의 독립 그룹 간 비교를 위해 수행됩니다. 10.4. P-값은 양측이었고 P<0.05.11인 경우 유의미한 것으로 간주되었습니다.