«Изучение роли ключевых эпигенетических медиаторов у больных раком молочной железы»

Рак молочной железы считается одним из наиболее частых злокачественных новообразований у женщин во всем мире и одной из ведущих причин смертности среди женщин во всем мире. Даже несмотря на значительные достижения в диагностике и терапии, прогноз больных раком молочной железы остается неутешительным[1][2]. Рак молочной железы представляет собой весьма гетерогенное заболевание, которое подразделяется на четыре подтипа на основе экспрессии определенных гормональных рецепторов, таких как рецептор эстрогена ER, рецептор прогестерона PR и рецептор человеческого эпидермального фактора роста HER2 [2]. Ниже приведены четыре подтипа рака молочной железы: Опухоли люминала А характеризуются наличием ER и/или PR и отсутствием HER2, опухоли люминала B имеют более высокую степень злокачественности и худший прогноз по сравнению с люмином А, они ER-положительные и могут быть PR-отрицательными и иметь высокую экспрессию Ki67 (более 20%), HER2-положительная группа составляет 10-15% случаев рака молочной железы и характеризуется высокой Экспрессия HER2 при отсутствии ER и PR и трижды негативный рак молочной железы, при котором отсутствует экспрессия трех предыдущих рецепторов[3][4].

Эпигенетическая регуляция экспрессии генов представляет собой изменение функции экспрессии генов без изменения нуклеотидной последовательности. Как активация, так и инактивация генов, связанных с раком, могут происходить посредством эпигенетических механизмов. Основными участниками эпигенетических механизмов регуляции генов являются метилирование ДНК, модификация гистонов, ремоделирование хроматина и экспрессия некодирующей РНК [5].

Модификации гистонов являются одним из важных регуляторов структуры хроматина, который имеет решающее значение для экспрессии генов, поскольку определяет доступность ДНК для регуляторов транскрипции, влияет на экспрессию генов и влияет на жизненно важные клеточные процессы [6].

Модификации гистонов могут рекрутировать транскрипционные факторы, ремоделеры хроматина и структурные белки хроматина, что способствует формированию и поддержанию активного или репрессивного состояния хроматина [6]. Наиболее важными модификациями гистонов являются: ацетилирование лизина, метилирование лизина и аргинина, фосфорилирование серина/треонина/тирозина и убиквитилирование серина/треонина [6]. Многие ферменты модификации гистонов часто мутируют при различных типах рака, например: EHMT2 (G9A) кодирует метилтрансферазу, которая метилирует остатки лизина гистона H3. Метилирование H3 по лизину 9 этим белком приводит к привлечению дополнительных эпигенетических регуляторов и репрессии транскрипция. Гистон-метилтрансфераза G9a хорошо известна своим участием в росте опухолей [7]. Другим примером ферментов модификации гистонов является KMT5B (SUV420H1), фермент метилтрансферазы, который катализирует отложение метки H4k20me, репрессивной метки и, как полагают, играет роль супрессора опухоли при многих типах рака.

Структуру хроматина также могут регулировать комплексы ремоделеров хроматина — четыре консервативных семейства АТФ-зависимых ремоделаторов хроматина у млекопитающих (CHD), (ISWI), (INO80) и (SWI/SNF), которые участвуют в большинстве важнейшие клеточные процессы [9].

Механизм модификации хроматина сильно нарушен при раке, включая, например, рак молочной железы: мутации или инактивация генов, кодирующих субъединицы комплекса SWI/SNF, обнаруживаются примерно в 20% случаев рака [10].

Другим важным эпигенетическим механизмом является влияние некодирующих РНК на экспрессию генов.

Некодирующие РНК (нкРНК) представляют собой гетерогенную группу транскриптов, которые не транслируются в белки. Они стали важными регуляторами множества биологических функций, а нарушение их регуляции приводит к развитию заболеваний, включая рак. Они вызвали огромный интерес среди научного сообщества благодаря их использованию в качестве биомаркеров заболеваний. Существует много типов нкРНК, включая микроРНК и днРНК [11].

МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие высококонсервативные некодирующие молекулы РНК (18-25 нуклеотидов), участвующие в регуляции экспрессии генов. Многочисленные исследования показали, что микроРНК (миРНК) являются новыми регуляторами, действующими как супрессоры опухолей или онкогены при прогрессировании опухоли [12]. Сообщалось, что экзосомальная миР-138-5p оказывает онкогенную функцию у больных раком молочной железы путем ингибирования белка KDM6B [13]. Доктор медицинских наук Пэн Бянь и др. сообщили, что экспрессия миР-4306, как сообщается, снижается в тканях рака молочной железы по сравнению с соседними тканями [14].

Длинные некодирующие РНК (днРНК) — это еще один тип некодирующих РНК, длина которых превышает 200 нуклеотидов, и большинство из них не транслируются в белки[15]. Несмотря на то, что большинство днРНК не транслируются, они вызвали огромный интерес в исследованиях благодаря своим регуляторным функциям в отношении экспрессии генов других генов-мишеней[15]. LncRNA регулируют экспрессию генов на эпигенетическом, транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях путем взаимодействия с мРНК, ДНК, белком и микроРНК [16]. Кроме того, они играют решающую роль в поддержании биологических процессов, таких как модификация гистонов, ремоделирование хроматина, транскрипционная интерференция, активация транскрипции, трансляция мРНК и процессинг РНК [16]. Недавно было заявлено, что днРНК участвуют во многих видах рака, таких как рак легких, рак печени, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря и рак молочной железы [2], поэтому их можно использовать в качестве нового биомаркера и фармацевтической мишени в терапии рака [17]. Например, онкогенная днРНК PVT1 способствует пролиферации клеток рака молочной железы через ось miR-181a-2-3p/ESR1 [18]. Важно отметить, что днРНК могут взаимодействовать с комплексами, модифицирующими и ремоделирующими хроматин, жестко регулируя многие нормальные клеточные пути, а также канцерогенные пути. Они могут регулировать механизм модификации хроматина либо путем прямого взаимодействия, либо опосредованно, посредством поглощения определенных микроРНК. Пример прямого взаимодействия при раке: LncRNA UCA1 регулирует ремоделирование хроматина посредством связывания со SMARCA4, нарушая его связывание с его участком на промоторе p21, что приводит к пролиферации рака мочевого пузыря [19]. Пример непрямого взаимодействия при раке: LncRNA-MIAT способствует прогрессированию рака щитовидной железы и действует как ceRNA, нацеливаясь на EZH2, поглощая миР-150-5p [20].

LncRNAs можно обнаружить в плазме/сыворотке, поэтому они действуют как неинвазивный биомаркер [21].

LncRNA UPK1A-AS1 — недавно идентифицированный биомаркер рака. Сообщалось, что он играет онкогенную роль при раке поджелудочной железы, придавая резистентность к платине за счет восстановления двухцепочечных разрывов [22]. Более того, было заявлено, что UPK1A-AS1 способствует пролиферации ГЦК путем взаимодействия с EZH2 [23]. Несмотря на то, что днРНК UPK1A-AS1, как сообщалось, была онкогенной в клеточных линиях ГЦК, рака поджелудочной железы и рака легких, считалось, что она играет роль супрессора опухоли при раке клеток плоскоклеточной карциномы пищевода посредством губчатой ​​миР-1248[24][ 25].

LncRNA UNC5B-AS1 признана онкогеном рака щитовидной железы, рака простаты и ГЦК [26] [27]. Также было заявлено, что он играет онкогенную роль при раке яичников посредством регулирования модификации гистонов [28].

Однако роль днРНК UPK1A-AS1 и UNC5B-AS1 в патогенезе больных раком молочной железы пока не выявлена.

1.2. Определение проблемы. В Египте рак молочной железы является наиболее распространенным злокачественным заболеванием среди женщин, причем большинство случаев диагностируется на поздней стадии с плохим прогнозом[29]. В 2050 году прогнозируется около 46 000 случаев инцидентов. Хотя уровень заболеваемости в Египте ниже мировых показателей, уровень смертности значительно выше по сравнению с развитыми странами примерно в 2 раза (41% против 23%) [30]. Таким образом, предоставление новых маркеров для диагностики и/или прогноза рака молочной железы, а также понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе их связи с канцерогенезом, остается проблемой в ведении и лечении рака молочной железы.

1.3. Гипотеза. Постановка задачи заключается в том, чтобы предоставить новые маркеры, которые ранее не изучались у больных раком молочной железы, чтобы помочь в диагностике и прогнозировании этого агрессивного заболевания. Соответственно, в настоящем исследовании мы будем исследовать роль длинных некодирующих РНК UPK1A-AS1 и/или UNC5B-AS1 как возможных диагностических и/или прогностических маркеров при раке молочной железы. Кроме того, будут исследованы возможные перекрестные помехи и корреляция между этими длинными некодирующими РНК и ферментами модификации хроматина и/или комплексами ремоделирования, такими как KMT5B и G9A, посредством спонжирования определенных целевых микроРНК, таких как mir-138-5p и mir-4306. 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРЕДЫДУЩИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Чжан и др. сообщили, что: UPK1A-AS1 способствует развитию ГЦК путем ускорения прогрессирования клеточного цикла за счет взаимодействия с EZH2 и поглощения миР-138-5p [23].

2.2. Ван и др. сообщили, что: UNC5B-AS1 способствует прогрессированию рака яичников, регулируя H3K27me на NDRG2 через EZH2 [28].

2.3. Хауанг и др. сообщили, что: UNC5B-AS1 способствует пролиферации, миграции и EMT клеток гепатоцеллюлярной карциномы посредством регуляции оси miR-4306/KDM2A [26].

3. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценка уровней экспрессии наших кандидатных днРНК UPK1A-AS1 и/или UNC5B-AS1 и их корреляция с различными клиническими параметрами у больных раком молочной железы и прояснение их возможных перекрестных помех с белками, модифицирующими и/или ремоделирующими хроматин. как KMT5B и G9A у пациентов с раком молочной железы посредством спонжирования определенных целевых микроРНК, таких как mir-138-5p и mir-4306.

4. ЦЕЛЬ(И) ИССЛЕДОВАНИЯ 4.1. Измерьте экспрессию генов lncRNA UPK1A-AS1 и/или UNC5B-AS1 и их целевых микроРНК в образцах сыворотки (жидкая биопсия) и/или образцах тканей пациентов с раком молочной железы, используя метод количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR).

4.2. Измерьте уровень целевых белков сыворотки и/или ткани с помощью ELISA. 4.3. Сравните уровень экспрессии этих нкРНК с классическими белками-маркерами опухолей, 4.4. Коррелируйте эти нкРНК и ось уровня целевого белка с клинико-патологическими характеристиками рака молочной железы, такими как стадия и степень опухоли, прогрессирование опухоли (TNM) и другими классическими клинико-патологическими прогностическими биомаркерами, такими как карциноэмбриональный антиген (CEA), раковый антиген 15-3 (CA15-3). ), (ER), (PR), рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2/neu), маркер пролиферации Ki-67 или PCNA и полный общий анализ крови (CBC), ИМТ, АД, уровень глюкозы в крови и инсулина.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 5.1. Начальный. Выясните роль наших кандидатов lncRNA и их последующих мишеней, полученных из жидкой биопсии пациентов с раком молочной железы и/или образцов тканей.

5.2. Публикация(и)/результат наглядности. Обзорная статья + одна международная публикация Scopus Q1, посвященная найденным результатам + представление результатов на международной конференции с высокой репутацией.

6. ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ 6.1. Насколько нам известно, это первая исследовательская работа по измерению уровня экспрессии UPK1A-AS1 и/или UNC5B-AS1 в клинических образцах рака молочной железы.

6.2. Эти данные могут обеспечить многообещающий подход к внедрению новых маркеров, которые помогут в диагностике и прогнозировании рака молочной железы и станут потенциальными мишенями для генной терапии.

7. МЕТОДОЛОГИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ 7.1. Биоинформатический анализ 7.1.1. Исследование экспрессии наших кандидатов днРНК в образцах рака молочной железы с помощью интерактивного анализа профиля экспрессии генов (GEPIA) на основе данных Атласа генома рака (TCGA).

7.1.2. Исследование целевых микроРНК с помощью инструментов биоинформатики и/или экспериментальных исследований с использованием онлайн-программы miRcode (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. Исследование выбранных генов-мишеней микроРНК с помощью онлайн-инструментов микроРНК: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase или ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ и целевое сканирование: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Анализ путей или онтология генов для списка генов-мишеней через базу данных обогащения, список генов-мишеней анализировали на предмет их связи с белками, модифицирующими и/или ремоделирующими хроматин.

8. ЭТИЧЕСКОЕ ЗАЯВЛЕНИЕ 8.1.1. Это исследование будет проводиться в соответствии с руководящими принципами, установленными Хельсинкской декларацией, со ссылкой на этические рекомендации Всемирной медицинской ассоциации (WMA) для медицинских исследований на людях, первоначально опубликованные в 1964 году и пересмотренные в 2013 году и октябре 2018 года. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Образцы будут собраны после заявления участника и подписания информированного согласия.

8.1.2. Этическое одобрение и согласие на участие. Это исследование было впервые одобрено Комитетом по этике исследований (REC) фармацевтического факультета Университета Айн-Шамс. 9. РАЗМЕР ВЫБОРКИ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ 9.1. Предполагаемый размер выборки был рассчитан с помощью онлайн-калькулятора размера выборки G power* http://www.gpower.hhu.de/en.html, используя следующие входные данные: вероятность ошибки α (0,05), мощность исследования (0,8). На основании предыдущих исследований, проведенных Бианом и др., 2021 г.; Хуангом и др., 2021 г.; Тан и др., 2020 г.; Madhvan et al, 2014 [31] [12] [24] [25] показали размер эффекта от умеренного до высокого, для расчета размера выборки был выбран умеренный размер эффекта (0,5).

Общий размер выборки составит 102 случая, это число будет разделено на 2 группы либо в соотношении 50:50, либо в соотношении 60:40.

9.2. Дизайн исследования. Ретроспективное моноцентровое исследование «случай-контроль». 9.3. Участники исследования. Группа египетских женщин, больных раком молочной железы, будет набрана из отделения рака молочной железы кафедры клинической онкологии Университета Айн-Шамс, Каир, Египет.

Группа 1; пациенты со злокачественным неметастатическим раком молочной железы; впервые диагностированные пациенты с раком молочной железы.

группа 2; контрольная группа; здоровые волонтеры. 9.3.1 Клинико-патологический Критерии. Клинические данные получены из медицинских записей и оригинальных отчетов о патологии. Эти данные необходимо скомпилировать в подробный файл Excel.

Следующие клинические данные необходимо записать и оценить, как в прилагаемом файле Excel.

• Полный семейный анамнез будет записан для всех участников рака молочной железы.
• Индивидуальный анамнез рака и клиническая оценка опухоли, проведенная с использованием классификации (TNM) Американского объединенного комитета по раку (AJCC).
• Для гистологической оценки будет использоваться шкала Блума-Ричардсона.
• Характеристики больных раком молочной железы с точки зрения индекса массы тела (ИМТ), общего анализа крови, менопаузального статуса, гистопатологических типов рака молочной железы; инвазивная протоковая карцинома (IDC) и инвазивная дольковая карцинома (ILC). Молекулярные классификации рака молочной железы: люминальный A, B, тройной негативный рак молочной железы.
• Данные о размере опухоли, а также клинико-патологических биомаркерах CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 или PCNA (если таковые имеются) будут собраны из файлов пациентов для дальнейшей корреляции и статистического анализа.

9.3.2. Критерии включения; Египетские женщины, больные раком молочной железы в возрасте 18 лет и старше, у которых впервые диагностирован рак молочной железы.

9.3.3 Критерии исключения; заболевания крови, любой рак, кроме рака молочной железы, цирроза печени и заболеваний матки и мочевого пузыря, или пациенты с раком молочной железы с любыми признаками отдаленных метастазов.

9.4. Отбор проб крови: 6 мл периферической крови собирают в полимерные гелевые вакутейнеры с активатором свертывания (Greiner Bio-One GmbH, Австралия) и оставляют на 15 минут. при комнатной температуре для свертывания, затем 10 мин. центрифугированием при 10 000 g при 4°C, полученную сыворотку разливают в 5 чистых пробирок Эппендорфа и хранят при -80°C до биохимической оценки на кафедре биохимии фармацевтического факультета Университета Айн-Шамс.

9.4.1 Сохраненные сыворотки будут использоваться для измерения целевых уровней белка методом ELISA с использованием коммерчески доступных наборов ELISA в соответствии с инструкциями производителя.

9.4.2. Геномная РНК будет извлечена; Экстракция нкРНК из образцов сыворотки и оценка очистки. Количественная оценка уровня экспрессии нкРНК с использованием qRT-PCR, шаг один плюс. Мы продолжим экстракцию общей РНК из образца сыворотки с помощью набора miRNeasy Mini Kit. Синтез к-ДНК впоследствии будет осуществляться с использованием набора для синтеза к-ДНК VERSO (Thermo Scientific, США).

Далее мы проведем количественный анализ ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) с использованием мастер-микса sybr green PCR (Thermo Scientific, США) и специфических праймеров, разработанных для целевых нкРНК, а также эталонного гена домашнего хозяйства.

10. СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ 10.1. Данные будут собраны, сведены в таблицу Excel, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) версии 20, будет использоваться программа или Stat4 или Graphpad Prism для рисунков, 10.3. Данные будут проверены на нормальность с помощью калькулятора Шапиро-Уилка, 10.3.1. Нормально распределенные переменные должны быть выражены как среднее значение + (SEM) и проанализированы с использованием двух выборок, независимые t-критерий Стьюдента и ANOVA должны использоваться для сравнения 2 или более групп, если они нормально распределены, соответственно.

10.3.2. Корректировка и нормализация искажающих факторов, таких как возраст и ИМТ, ... между контролем и пациентами, а также множественный регрессионный анализ или ANCOVA для прогнозирования искажающего фактора, 10.3.3. Данные, представленные в виде медианы (диапазон), если они не распределены нормально, Манна-Уитни (U) или Крускала-Уоллиса (H), будут проводиться для сравнения между любыми двумя или более независимыми группами соответственно. 10.4. Значения P были двусторонними и считались значимыми, если P <0,05,11.