“研究关键表观遗传介质在乳腺癌患者中的作用”

乳腺癌被认为是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，也是全球女性死亡的主要原因之一。 尽管诊断和治疗取得了显着进步，乳腺癌患者的预后仍然令人失望[1][2]。 乳腺癌是一种高度异质性的疾病，根据某些激素受体的表达，如雌激素受体 ER、孕激素受体 PR 和人表皮生长因子受体 HER2，分为四种亚型[2]。 以下是乳腺癌的四种亚型： Luminal A 肿瘤的特点是存在 ER 和/或 PR 而缺乏 HER2，Luminal B 肿瘤与 Luminal A 相比，级别更高，预后更差，它们是 ER 阳性且PR阴性且Ki67高表达（大于20%），HER2阳性组占乳腺癌的10-15%，其特点是HER2高表达而缺乏ER和PR以及缺乏前三种受体表达的三阴性乳腺癌[3][4]。

基因表达的表观遗传学调控是在不改变核苷酸序列的情况下改变基因表达功能。 癌症相关基因的激活和失活都可以通过表观遗传机制发生。 基因调控表观遗传机制的主要参与者是 DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码 RNA 表达 [5]。

组蛋白修饰是染色质结构的重要调节因子之一，对于基因表达非常重要，因为它定义了转录调节因子的 DNA 可及性，影响基因表达，并影响重要的细胞过程 [6]。

组蛋白修饰可以招募转录因子、染色质重塑剂和染色质结构蛋白，从而有助于活跃或抑制染色质状态的形成和维持[6]。 最重要的组蛋白修饰是：赖氨酸乙酰化、赖氨酸和精氨酸甲基化、丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化和丝氨酸/苏氨酸泛素化[6]。 许多组蛋白修饰酶在不同类型的癌症中经常发生突变，例如：EHMT2 (G9A) 编码一种甲基转移酶，可甲基化组蛋白 H3 的赖氨酸残基，该蛋白对 H3 赖氨酸 9 的甲基化导致招募额外的表观遗传调节因子并抑制转录。 组蛋白甲基转移酶 G9a 在肿瘤生长中的作用已得到充分证实 [7]。 组蛋白修饰酶的另一个例子是 KMT5B (SUV420H1)，一种甲基转移酶，可催化 H4k20me 标记的沉积，这是一种抑制性标记，被认为在许多癌症类型中具有肿瘤抑制作用 [8]。

染色质结构也可以通过染色质重塑复合物来调节，它们是哺乳动物中四个保守的ATP依赖性染色质重塑家族（CHD）、（ISWI）、（INO80）和（SWI/SNF），并且参与大多数染色质重塑家族。重要的细胞过程[9]。

染色质修饰机制在包括乳腺癌在内的癌症中高度失调：在大约 20% 的癌症中发现了编码 SWI/SNF 复合物亚基的基因的突变或失活[10]。

另一个重要的表观遗传机制是非编码RNA对基因表达的影响。

非编码 RNA (ncRNA) 是一组不翻译成蛋白质的异质转录物。 它们已成为多种生物功能的重要调节因子，它们的失调与包括癌症在内的疾病有关。 由于它们用作疾病生物标志物，它们引起了科学界的巨大兴趣。 ncRNA 有多种类型，包括 miRNA 和 lncRNA[11]。

MicroRNA (miRNA) 是小型、高度保守的非编码 RNA 分子 (18-25) 个核苷酸，参与基因表达的调节。 越来越多的研究已经发现，microRNA (miRNA) 是一种新型调节因子，在肿瘤进展中充当肿瘤抑制因子或癌基因[12]。 据报道，外泌体miR-138-5p通过抑制KDM6B蛋白在乳腺癌患者中发挥致癌功能[13]。 Peng Bian MD等报道，与癌旁组织相比，乳腺癌组织中miR-4306的表达下调[14]。

长非编码RNA（lncRNA）是另一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA，其中大多数不翻译成蛋白质[15]。 尽管大多数lncRNA不被翻译，但由于它们对其他靶基因表达的调节功能，它们引起了研究的巨大兴趣[15]。 LncRNA 通过与 mRNA、DNA、蛋白质和 miRNA 相互作用，在表观遗传、转录、转录后、翻译和翻译后水平上调节基因表达[16]。 此外，它们在维持组蛋白修饰、染色质重塑、转录干扰、转录激活、mRNA 翻译和 RNA 加工等生物过程中发挥着至关重要的作用[16]。 最近有报道称lncRNA与肺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌等多种癌症有关[2]，因此它们可以作为癌症治疗中的新型生物标志物和药物靶点[17]。 例如，致癌lncRNA PVT1通过miR-181a-2-3p/ESR1轴促进乳腺癌细胞的增殖[18]。 重要的是，lncRNA 可以与染色质修饰和重塑复合物发生串扰，从而严格调节许多正常细胞途径以及致癌途径。 它们可以通过直接相互作用或通过海绵化某些 miRNA 来间接调节染色质修饰机制。 癌症中直接相互作用的示例：LncRNA UCA1 通过与 SMARCA4 结合来调节染色质重塑，削弱其与 p21 启动子区域的结合，从而导致膀胱癌增殖[19]。 癌症中间接相互作用的示例：LncRNA-MIAT 促进甲状腺癌进展，并通过海绵 miR-150-5p 作为 ceRNA 靶向 EZH2 [20]。

LncRNA 可在血浆/血清中检测到，因此可作为非侵入性生物标志物[21]。

LncRNA UPK1A-AS1 是一种新发现的癌症生物标志物。 据报道，它通过双链断裂修复赋予铂耐药性，从而在胰腺癌中发挥致癌作用[22]。 此外，据称UPK1A-AS1通过与EZH2相互作用促进HCC的增殖[23]。 尽管据报道 lncRNA UPK1A-AS1 在 HCC、胰腺癌和肺癌细胞系中具有致癌性，但人们相信它通过海绵 miR-1248 在食管鳞状细胞癌细胞中具有肿瘤抑制作用[24]。 25]。

LncRNA UNC5B-AS1已被认为是甲状腺癌、前列腺癌和HCC的癌基因[26][27]。 还有人指出，它通过调节组蛋白修饰在卵巢癌中具有致癌作用[28]。

然而，lncRNA UPK1A-AS1和UNC5B-AS1在乳腺癌患者发病机制中的作用尚未被揭示。

1.2. 问题定义。 在埃及，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，大多数病例诊断时已处于晚期，预后较差[29]。 预计 2050 年将发生约 46,000 起事故。 尽管埃及的发病率低于全球数字，但死亡率却比发达国家高出约2倍（41% vs 23%）[30]。 因此，为乳腺癌诊断和/或预后提供新的标志物以及了解其与癌发生相关的分子机制仍然是乳腺癌管理和治疗中的挑战。

1.3. 假设。 由于问题陈述是提供以前未在乳腺癌患者中研究过的新标记物，以帮助这种侵袭性疾病的诊断和预后。 因此，在本研究中，我们将研究长非编码 RNA UPK1A-AS1 和/或 UNC5B-AS1 作为乳腺癌可能的诊断和/或预后标志物的作用。 此外，还将研究这些长非编码RNA与染色质修饰酶和/或重构复合物（如KMT5B和G9A）之间可能的串扰和相关性，通过海绵某些靶标miRNA（如mir-138-5p和mir-4306）。 2. 先前的研究结果 2.1。 张等人。报道称：UPK1A-AS1 通过与 EZH2 相互作用和 miR-138-5p 海绵作用加速细胞周期进程，从而促进 HCC 发展 [23]。

2.2. 王等人。报道称：UNC5B-AS1通过EZH2调节NDRG2上的H3K27me，促进卵巢癌进展[28]。

2.3. 豪昂等人。报道称：UNC5B-AS1通过调节miR-4306/KDM2A轴促进肝细胞癌细胞的增殖、迁移和EMT[26]。

3. 工作目的 估计我们的候选 lncRNA UPK1A-AS1 和/或 UNC5B-AS1 的表达水平，并将其与乳腺癌患者的不同临床参数相关联，并揭示它们与染色质修饰和/或重塑蛋白可能的串扰通过海绵某些靶标 miRNA（如 mir-138-5p 和 mir-4306），在乳腺癌患者中检测到 KMT5B 和 G9A。

4. 研究目标 4.1。 使用定量实时聚合酶链反应技术 (qRT-PCR) 测量乳腺癌患者血清样本（液体活检）和/或组织样本中的 lncRNA UPK1A-AS1 和/或 UNC5B-AS1 及其目标 miRNA 基因表达。

4.2. 通过 ELISA 测量血清和/或组织靶蛋白水平。 4.3. 将这些 ncRNA 表达水平与经典蛋白质肿瘤标志物进行比较，4.4。 将这些 ncRNA 和靶蛋白水平轴与乳腺癌的临床病理学特征（如肿瘤分期和分级、肿瘤进展 (TNM) 以及其他经典临床病理学预后生物标志物，如癌胚抗原 (CEA)、癌抗原 15-3 (CA15-3)）相关联)、(ER)、(PR)、人表皮生长因子受体 2 (HER2/neu)、增殖标志物 Ki-67 或 PCNA 和全血计数 (CBC)、BMI、血压、血糖水平和胰岛素。

5. 研究成果 5.1。 基本的。 阐明我们的候选 lncRNA 及其从乳腺癌患者的液体活检和/或组织样本中获得的下游靶标的作用。

5.2. 出版物/可见度结果。 评论文章 + 一篇涉及发现结果的国际 Scopus Q1 出版物 + 在国际高声誉会议上展示发现。

6. 研究意义 6.1. 据我们所知，这是第一个测量乳腺癌临床样本中 UPK1A-AS1 和/或 UNC5B-AS1 表达水平的研究工作。

6.2. 这些数据可以提供一种有前景的方法来引入新的标记物，帮助乳腺癌的诊断和预后，并为基因治疗提供潜在的靶点。

7. 研究方法 7.1。 7.1.1. 生物信息学分析 基于癌症基因组图谱数据 (TCGA) 的数据，通过基因表达谱交互分析 (GEPIA) 调查乳腺癌样本中的候选 lncRNA 表达。

7.1.2. 通过生物信息学工具和/或使用在线软件 miRcode (http://mircode.org/index.php) 进行实验研究来研究目标 miRNA。

7.1.3. 通过 miRNA 在线工具研究选定的 miRNA 靶基因：miRDB https://mirdb.org/index.html， starBase 或 ENCORI：https://rnasysu.com/encori/ 和目标扫描：https://www.targetscan.org/vert_80/。

7.1.4. 通过richr数据库对目标基因列表进行路径分析或基因本体论，分析目标基因列表与染色质修饰和/或重塑蛋白的关系。

8. 道德声明 8.1.1。 这项研究将按照赫尔辛基宣言制定的指南进行，该指南参考了世界医学协会 (WMA) 人类受试者医学研究伦理指南，该指南最初于 1964 年发布，于 2013 年和 2018 年 10 月修订。 （https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving- human-subjects/）。

样品将在参与者宣布并签署知情同意书后收集。

8.1.2. 道德批准和同意参与。 这项研究首先得到了艾因夏姆斯大学药学院研究伦理委员会（REC）的批准。 9. 样本量和研究的力量 9.1。 估计样本量通过 G power* 样本量在线计算器 http://www.gpower.hhu.de/en.html 计算， 使用以下输入数据：α 错误概率为 (0.05)，研究功效 (0.8)。 基于 Bian 等人之前进行的研究，2021；Huang 等人，2021；谭等人，2020； Madhvan 等人，2014 [31] [12] [24] [25] 显示中等到高效应大小，选择中等效应大小（0.5）来计算样本大小。

总样本量为 102 例，该数字将按 50:50 或 60:40 的比例分为 2 组。

9.2. 研究设计。 病例对照、回顾性、单中心研究。 9.3. 研究参与者。 将从埃及开罗艾因夏姆斯大学临床肿瘤科乳腺癌科招募一系列埃及女性乳腺癌患者。

第 1 组；恶性非转移性乳腺癌患者；新诊断的乳腺癌患者。

第 2 组；对照组；健康的志愿者。 9.3.1临床病理学 标准。 临床数据来自医疗记录和原始病理报告。 这些数据被编译成详细的Excel文件。

以下临床数据将按照随附的 Excel 文件进行记录和评估。

• 所有乳腺癌参与者的完整家族史都将被记录。
• 使用美国癌症联合委员会 (AJCC) 的 (TNM) 分类进行个人癌症病史和肿瘤临床评估。
• Bloom-Richardson 分级将用于组织学分级。
• 乳腺癌患者的体重指数（BMI）、全血细胞计数（CBC）、绝经状态、乳腺癌组织病理学类型等特征；浸润性导管癌（IDC）和浸润性小叶癌（ILC）。 乳腺癌分子分类管腔A、B、三阴性乳腺癌。
• 将从患者档案中收集肿瘤大小以及临床病理生物标志物 CEA、CA15-3、ER、PR、Her2/neu、Ki-67 或 PCNA（如果有）数据，以进行进一步的相关性和统计分析。

9.3.2. 纳入标准；埃及女性乳腺癌患者年龄18岁及以上，新诊断患有乳腺癌。

9.3.3 排除标准；血液疾病、除乳腺癌、肝硬化和子宫及膀胱疾病以外的任何癌症或有任何远处转移证据的乳腺癌患者。

9.4. 血液采样：将6ml外周血收集到带有凝块激活剂的聚合物凝胶真空采血管(Greiner Bio-One GmbH，澳大利亚)中，放置15分钟。 室温下凝固，然后 10 分钟。 4°C 10,000g离心，将获得的血清等分到5个干净的Eppendorf管中并储存在-80°C下，直到艾因夏姆斯大学药学院生物化学系进行生化评估。

9.4.1 储存的血清将用于 ELISA 技术测量目标蛋白水平，根据制造商的说明使用市售 ELISA 试剂盒。

9.4.2. 将提取基因组RNA；从血清样品中提取 ncRNA 并进行纯化评估。 ncRNA 表达水平定量，使用 qRT-PCR 按步骤一加。 我们将使用 miRNeasy Mini Kit 从血清样本中提取总 RNA。 随后将使用 VERSO c-DNA 合成试剂盒（Thermo Scientific，美国）完成 c-DNA 合成。

接下来，我们将使用 sybr green PCR master mix（Thermo Scientific，美国）和针对目标 ncRNA 以及管家参考基因设计的特异性引物进行定量实时 PCR (qRT-PCR) 分析。

10. 统计分析 10.1。 10.2. 将收集数据，并以 Excel 表格形式显示。 SPSS IMB USA（SPSS，芝加哥，伊利诺伊州）版本 20，将是用于数字的程序或 Stat4 或 Graphpad Prism，10.3。 数据将通过 Shapiro-Wilk 计算器 10.3.1 进行正态性测试。 正态分布变量将表示为均值+(S.E.M)，并使用两个样本独立学生 t 检验进行分析，如果正态分布，则分别使用方差分析来比较 2 个或更多组。

10.3.2. 对照和患者之间年龄和 BMI 等混杂因素的调整和标准化，以及预测混杂因素的多元回归分析或 ANCOVA，10.3.3。 数据以中位数（范围）表示，如果不是正态分布，将分别进行曼-惠特尼（U）或克鲁斯卡尔-沃利斯（H）在任何两个或多个独立组之间进行比较，10.4。 P 值是双尾的，如果 P <0.05.11，则认为显着。