"Undersøgelse af rollen som centrale epigenetiske mediatorer i brystkræftpatienter"

Brystkræft anses for at være en af ​​de hyppigste maligne sygdomme hos kvinder på verdensplan og en af ​​de førende dødsårsager blandt kvinder globalt. Selv med bemærkelsesværdige fremskridt inden for diagnose og terapi forbliver prognosen for brystkræftpatienter skuffende[1][2]. Brystkræft er en meget heterogen sygdom, der er klassificeret i fire undertyper baseret på ekspressionen af ​​visse hormonelle receptorer som østrogenreceptor ER, progesteronreceptor PR og human epidermal vækstfaktorreceptor HER2[2]. Følgende er de fire undertyper af brystkræft: Luminal A-tumorer er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​ER og/eller PR og fravær af HER2, Luminal B-tumorer er af højere grad og dårligere prognose sammenlignet med Luminal A, de er ER-positive og kan være PR-negativ og have et højt udtryk af Ki67 (større end 20%), den HER2-positive gruppe udgør 10-15% af brystkræfttilfældene og er karakteriseret ved høj HER2-ekspression med fravær af ER og PR og Triple-negativ brystkræft, som mangler ekspressionen af ​​de tidligere tre receptorer[3][4].

Epigenetisk regulering af genekspression er ændringen i genekspressionsfunktionen uden at ændre nukleotidsekvensen. Både aktivering og inaktivering af kræft-associerede gener kan forekomme ved epigenetiske mekanismer. De vigtigste aktører i epigenetiske mekanismer for genregulering er DNA-methylering, histonmodifikation, kromatin-omformere og ikke-kodende RNA-ekspression[5].

Histonmodifikationer er en af ​​de vigtige regulatorer af kromatinstruktur, som er meget afgørende for genekspression, da den definerer tilgængeligheden af ​​DNA for transkriptionelle regulatorer, påvirker genekspression og påvirker vitale cellulære processer [6].

Histon-modifikationer kan rekruttere transkriptionsfaktorer, kromatin-remodelers og kromatin-strukturproteiner, så de bidrager til dannelsen og opretholdelsen af ​​aktiv eller repressiv kromatintilstand[6]. De vigtigste histonmodifikationer er: lysin acetylering, lysin og arginin methylering, serin/threonin/tyrosin phosphorylering og serin/threonin ubiquitylering [6]. Mange af histonmodifikationsenzymer muteres hyppigt i forskellige typer kræft, f.eks.: EHMT2 (G9A) koder for en methyltransferase, der methylerer lysinrester af histon H3, Methylering af H3 ved lysin 9 af dette protein resulterer i rekruttering af yderligere epigenetiske regulatorer og undertrykkelse af transskription. Histonmethyltransferase G9a er veldokumenteret for dens implikation i neoplastisk vækst[7]. Et andet eksempel på histonmodifikationsenzymer er KMT5B (SUV420H1) et methyltransferaseenzym, der katalyserer aflejringen af ​​H4k20me-mærket, et undertrykkende mærke og menes at have en tumorundertrykkende rolle i mange cancertyper[8].

Kromatinstrukturen kan også reguleres af kromatinremodelers komplekser, de er fire konserverede familier af ATP-afhængige kromatinremodelers i pattedyr (CHD), (ISWI), (INO80) og (SWI/SNF), og er involveret i de fleste essentielle celleprocesser [9].

Kromatinmodifikationsmaskineri er stærkt dysreguleret i kræftformer, herunder brystkræft, f.eks.: mutationer eller inaktivering af gener, der koder for underenheder af SWI/SNF-komplekset, findes i cirka 20 % af kræfttilfældene[10].

En anden vigtig epigenetisk mekanisme er effekten af ​​ikke-kodende RNA'er på genekspression.

Ikke-kodende RNA'er (ncRNA'er) er en heterogen gruppe af transkripter, der ikke oversættes til proteiner. De er dukket op som vigtige regulatorer af flere biologiske funktioner, og deres dysregulering har været impliceret i sygdomme, herunder kræft. De har fået en enorm interesse blandt det videnskabelige samfund på grund af deres brug som sygdomsbiomarkører. Der er mange typer ncRNA'er, herunder miRNA'er og lncRNA'er[11].

MikroRNA'er (miRNA'er) er små, stærkt konserverede ikke-kodende RNA-molekyler (18-25) nukleotider involveret i reguleringen af ​​genekspression. Akkumulerende undersøgelser har identificeret, at mikroRNA'er (miRNA'er) er nye regulatorer, der fungerer som tumorundertrykkere eller onkogener i tumorprogression[12]. Det blev rapporteret, at exosomal miR-138-5p udøver en onkogen funktion hos brystkræftpatienter via inhibering af KDM6B-protein[13]. Peng Bian MD et al rapporterede, at udtrykket af miR-4306 blev rapporteret at være nedreguleret i brystkræftvæv sammenlignet med tilstødende væv [14].

Lange ikke-kodende RNA'er (lncRNA'er) er en anden type ikke-kodende RNA'er, der er mere end 200 nukleotider lange, og de fleste af dem er ikke oversat til proteiner[15]. På trods af det faktum, at de fleste lncRNA'er ikke er oversat, har de fået enorm interesse for forskning på grund af deres regulatoriske funktioner på genekspression af andre målgener[15]. LncRNA'er regulerer genekspression på epigenetiske, transkriptionelle, post-transkriptionelle, translationelle og post-translationelle niveauer ved at interagere med mRNA, DNA, protein og miRNA[16]. Derudover har de en afgørende rolle i at opretholde biologiske processer som histonmodifikation, kromatin-ombygning, transkriptionel interferens, transkriptionel aktivering, mRNA-translation og RNA-behandling[16]. For nylig blev det udtalt, at lncRNA'er er involveret i mange kræftformer som lungekræft, leverkræft, prostatacancer, blærekræft og brystkræft[2], så de kan bruges som en ny biomarkør og farmaceutisk mål i cancerterapi [17]. For eksempel fremmer det onkogene lncRNA PVT1 spredningen af ​​brystkræftceller via miR-181a-2-3p/ESR1-aksen [18]. Det er vigtigt, at lncRNA'er kan have en krydstale med kromatinmodificerende og omdannende komplekser for at regulere mange normale cellulære veje såvel som kræftfremkaldende veje. De kan regulere kromatinmodifikationsmaskineriet, enten ved direkte interaktion eller indirekte via sponging af visse miRNA'er. Eksempel på direkte interaktion i cancer: LncRNA UCA1 regulerer kromatin-remodellering via binding med SMARCA4 for at forringe dets binding til dens region på p21-promotoren, hvilket fører til blærekræftproliferation[19]. Eksempel på indirekte interaktion i cancer: LncRNA-MIAT fremmer progression af skjoldbruskkirtelkræft og fungerer som ceRNA for at målrette EZH2 ved at sponge miR-150-5p[20].

LncRNA'er kan påvises i plasma/serum, så de fungerer som ikke-invasiv biomarkør[21].

LncRNA UPK1A-AS1 er en nyligt identificeret biomarkør i cancer. Det blev rapporteret, at det har en onkogen rolle i bugspytkirtelkræft ved at give platinresistens gennem reparation af dobbeltstrengsbrud[22]. Desuden blev det anført, at UPK1A-AS1 fremmede spredningen af ​​HCC ved at interagere med EZH2[23]. På trods af det faktum, at lncRNA UPK1A-AS1 blev rapporteret at være onkogen i HCC, bugspytkirtelkræft og lungecancer cellelinjer, blev det antaget, at det har en tumorundertrykkende rolle i esophageal planocellulær carcinomcellekræft via sponging miR-1248[24][24] 25].

LncRNA UNC5B-AS1 er blevet anerkendt som et onkogen i skjoldbruskkirtelkræft, prostatacancer og HCC[26] [27]. Det blev også anført, at det har en onkogen rolle i ovariecancer via regulering af histonmodifikation[28].

Rollen af ​​lncRNAs UPK1A-AS1 og UNC5B-AS1 i patogenesen af ​​brystkræftpatienter er dog endnu ikke blevet afsløret.

1.2. Problemdefinition. I Egypten er brystkræft den mest almindelige malignitet blandt kvinder, og de fleste af tilfældene bliver diagnosticeret på et sent stadium med dårlig prognose[29]. Der forventes ca. 46.000 hændelser i 2050. Selvom incidensraten i Egypten er lavere end de globale tal, er dødeligheden meget højere sammenlignet med de udviklede lande med ca. 2 gange (41% mod 23%) [30]. Så tilvejebringelse af nye markører for brystkræftdiagnose og/eller prognose samt forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for deres sammenhæng med carcinogenese, er fortsat en udfordring i håndtering og behandling af brystkræft.

1.3. Hypotese. Da problemformuleringen er at give nye markører, der ikke er blevet undersøgt hos brystkræftpatienter før, for at hjælpe med diagnosen og prognosen for denne aggressive sygdom. I overensstemmelse hermed vil vi i denne undersøgelse undersøge rollen af ​​lange ikke-kodende RNA'er UPK1A-AS1 og/eller UNC5B-AS1 som mulige diagnostiske og/eller prognostiske markører i brystkræft. Derudover vil den mulige krydstale og korrelation mellem disse lange ikke-kodende RNA'er og chromatinmodifikationsenzymer og/eller ombygningskomplekser som KMT5B og G9A via sponging af visse mål-miRNA'er som mir-138-5p og mir-4306 blive undersøgt. 2. TIDLIGERE UNDERSØGELSESRESULTATER 2.1. Zhang et al. rapporterede, at: UPK1A-AS1 fremmer HCC-udvikling ved at accelerere cellecyklusprogression gennem interaktion med EZH2 og sponging af miR-138-5p[23].

2.2. Wang et al. rapporterede, at: UNC5B-AS1 fremmede ovariecancerprogression ved at regulere H3K27me på NDRG2 via EZH2[28].

2.3. Hauang et al. rapporterede, at: UNC5B-AS1 fremmer spredning, migration og EMT af hepatocellulære carcinomceller via regulering af miR-4306/KDM2A-aksen[26].

3. FORMÅLET MED ARBEJDET Estimering af ekspressionsniveauerne af vores kandidat-lncRNA'er UPK1A-AS1 og/eller UNC5B-AS1 og korrelere det med forskellige kliniske parametre hos brystkræftpatienter og belyse deres mulige krydstale med kromatinmodificerende og/eller remodellerende proteiner som KMT5B og G9A hos brystkræftpatienter via sponging af visse mål-miRNA'er som mir-138-5p og mir-4306.

4. FORSKNINGSMÅL 4.1. Mål lncRNA UPK1A-AS1 og/eller UNC5B-AS1 og deres mål miRNAs genekspression i serumprøver (flydende biopsi) og/eller vævsprøver fra brystkræftpatienter ved hjælp af kvantitativ realtids polymerasekædereaktionsteknik (qRT-PCR).

4.2. Mål serum- og/eller vævsmålproteinniveau ved ELISA. 4.3. Sammenlign disse ncRNAs ekspressionsniveau med de klassiske proteintumormarkører, 4.4. Korreler disse ncRNA'er og målproteinniveauaksen til de klinisk-patologiske karakteristika ved brystkræft som tumorstadie og -grad, tumorprogression (TNM) og andre klassiske klinisk-patologiske prognostiske biomarkører såsom carcinoembryonalt antigen (CEA), cancerantigen 15-3 (CA15-3) ), (ER), (PR), human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2/neu), spredningsmarkøren Ki-67 eller PCNA og fuldstændig blodtælling (CBC), BMI, BP, blodsukkerniveau og insulin.

5. FORSKNINGSRESULTAT 5.1. Primær. Belyse rollen af ​​vores kandidat-lncRNA'er og deres downstream-mål opnået fra brystkræftpatienters flydende biopsi og/eller vævsprøver.

5.2. Publikation(er)/Synlighedsresultat. Anmeldelsesartikel + en international Scopus Q1-publikation, der omhandler fundne resultater + præsentation af resultater på en international konference med højt omdømme.

6. FORSKNINGS BETYDNING 6.1. Så vidt vi ved, er dette det første forskningsarbejde, der måler ekspressionsniveauet af UPK1A-AS1 og/eller UNC5B-AS1 i kliniske prøver af brystkræft.

6.2. Disse data kunne give en lovende tilgang til at introducere en ny markør, der hjælper med diagnosticering og prognose af brystkræft og giver et potentielt mål for genterapi.

7. FORSKNINGSMETODE 7.1. Bioinformatikanalyse 7.1.1. Undersøgelse af vores kandidat-lncRNA-ekspression i brystkræftprøver fra genekspressionsprofileringsinteraktiv analyse (GEPIA) baseret på data fra The Cancer Genome Atlas-data (TCGA).

7.1.2. Undersøgelse af mål miRNA'er ved hjælp af bioinformatikværktøjer og/eller eksperimentelle undersøgelser ved hjælp af onlinesoftwaren miRcode (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. Undersøgelse af udvalgte miRNA-målgener via miRNA-onlineværktøjer: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase eller ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ og målscanning: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Pathway-analyse eller Gene Ontology for liste over målgener via enrichr-database, listen over målgener blev analyseret for deres relation til kromatinmodificerende og/eller ombygningsproteiner.

8. ETISK ERKLÆRING 8.1.1. Denne forskning vil blive udført i overensstemmelse med retningslinjerne fastsat af Declaration of Helsinki, der henviser til World Medical Associations (WMA) etiske retningslinjer for medicinsk forskning med mennesker, oprindeligt offentliggjort i 1964, revideret i 2013 og oktober 2018. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Prøver vil blive indsamlet efter deltagerens meddelelse og underskrivelse af informeret samtykke.

8.1.2. Etisk godkendelse og samtykke til deltagelse. Denne undersøgelse blev først godkendt af den forskningsetiske komité (REC) ved Det Farmaceutiske Fakultet, Ain Shams University 9. PRØVESTØRRELSE OG STUDIEKRAFTEN 9.1. Estimeret prøvestørrelse blev beregnet ved hjælp af G-power* prøvestørrelse online-beregner http://www.gpower.hhu.de/en.html, ved hjælp af følgende inputdata: α fejlsandsynlighed er (0,05), undersøgelseskraften (0,8). Baseret på de tidligere undersøgelser udført af Bian et al, 2021 ;Huang et al, 2021; Tan et al, 2020; Madhvan et al, 2014 [31] [12] [24] [25], der viste moderat til høj effektstørrelse, blev en moderat effektstørrelse (0,5) valgt til at beregne stikprøvestørrelsen.

Samlet stikprøvestørrelse vil være 102 tilfælde, dette antal vil blive underopdelt i 2 grupper enten efter forholdet 50:50 eller efter forholdet 60:40.

9.2. Studiedesign. Case-kontrolleret, retrospektiv, mono-center undersøgelse. 9.3. Studiedeltagere. En række egyptiske kvindelige brystkræftpatienter vil blive rekrutteret fra brystkræftenheden, klinisk onkologisk afdeling, Ain Shams University, Cairo, Egypten.

gruppe 1; maligne ikke-metastatiske brystkræftpatienter; nydiagnosticerede brystkræftpatienter.

gruppe 2; kontrolgruppe; sunde frivillige. 9.3.1 Klinisk-patologisk Kriterier. Kliniske data indhentet fra lægejournaler og de originale patologirapporter. Disse data skal kompileres i en detaljeret Excel-fil.

Følgende kliniske data skal registreres og vurderes som i den vedhæftede excel-fil.

• Fuld familiehistorie vil blive registreret for alle brystkræftdeltagere.
• Individuel cancerhistorie og den kliniske tumorvurdering udført ved hjælp af (TNM) klassificeringen af ​​American Joint Committee on Cancer (AJCC).
• Bloom-Richardson-skalaen vil blive brugt til histologisk gradering.
• Karakteristika for brystkræftpatienter med hensyn til kropsmasseindeks (BMI), CBC, menopausal status, brystkræft histopatologiske typer; invasivt duktalt karcinom (IDC) og invasivt lobulært karcinom (ILC). Brystkræft molekylære klassifikationer luminal A, B, tredobbelt negativ brystkræft.
• Tumorstørrelse, såvel som klinisk-patologiske biomarkører CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 eller PCNA (hvis nogen) data vil blive indsamlet fra patientfiler til yderligere korrelationer og statistisk analyse.

9.3.2. Inklusionskriterier; Egyptiske kvinder med brystkræftpatienter i alderen 18 år og derover, nyligt diagnosticeret med brystkræft.

9.3.3 Eksklusionskriterier; blodsygdomme, andre kræftformer end brystkræft, levercirrose og livmoder- og urinblæresygdomme eller brystkræftpatienter med tegn på fjernmetastaser.

9.4. Blodprøvetagning: 6 ml perifert blod vil blive opsamlet i polymer gel vacutainere med koagelaktivator (Greiner Bio-One GmbH, Australien), efterladt i 15 min. ved stuetemperatur for at størkne, efterfulgt af en 10 min. centrifugering ved 10.000 g ved 4°C, vil de opnåede sera blive opdelt i 5 rene Eppendorf-rør og opbevaret ved -80°C, indtil biokemisk vurdering ved Biokemisk Institut, Det Farmaceutiske Fakultet, Ain-Shams University.

9.4.1 Opbevaret sera vil blive brugt til ELISA-teknikmålinger af målproteinniveauer ved at bruge kommercielt tilgængelige ELISA-kits i henhold til producentens instruktioner.

9.4.2. Genomisk RNA vil blive ekstraheret; ncRNA-ekstraktion fra serumprøver og oprensningsevaluering. kvantificering af ncRNAs ekspressionsniveau ved hjælp af qRT-PCR ved trin et plus. Vi vil fortsætte med total RNA-ekstraktion fra serumprøve ved hjælp af miRNeasy Mini Kit. c-DNA-syntesen udføres efterfølgende ved brug af VERSO c-DNA-syntesesæt (Thermo Scientific, USA).

Dernæst vil vi udføre kvantitative real-time PCR (qRT-PCR) analyser ved hjælp af sybr green PCR master mix (Thermo Scientific, USA) og specifikke primere designet til mål-ncRNA'erne samt husholdningsreferencegenet.

10. STATISTISK ANALYSE 10.1. Data vil blive indsamlet, Excel-tabel, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) version 20, vil være det brugte program eller Stat4 eller Graphpad Prism for figurer, 10.3. Data vil blive testet for normalitet af Shapiro-Wilk-beregneren, 10.3.1. Normalfordelte variable skal udtrykkes som middel+(S.E.M) og analyseres ved hjælp af to prøver, uafhængige studerendes t-test og ANOVA skal bruges til sammenligning af henholdsvis 2 eller flere grupper, hvis normalfordelt.

10.3.2. Justering og normalisering for confoundere som alder og BMI, .. mellem kontrol og patienter samt multipel regressionsanalyse eller ANCOVA for at forudsige en confounder, 10.3.3. Data, der skal præsenteres som median (område), hvis ikke normalfordelt, vil Mann-Whitney (U) eller Kruskal-Wallis (H) blive udført for at sammenligne mellem to eller flere uafhængige grupper, henholdsvis 10.4. P-værdier var to-halede og anses for signifikante, hvis P <0.05.11.