"Étudier le rôle des principaux médiateurs épigénétiques chez les patientes atteintes d'un cancer du sein"

Le cancer du sein est considéré comme l’une des tumeurs malignes les plus fréquentes chez les femmes dans le monde et l’une des principales causes de décès chez les femmes dans le monde. Même avec des progrès remarquables en matière de diagnostic et de traitement, le pronostic des patientes atteintes d'un cancer du sein reste décevant[1][2]. Le cancer du sein est une maladie très hétérogène qui est classée en quatre sous-types en fonction de l'expression de certains récepteurs hormonaux comme le récepteur des œstrogènes ER, le récepteur de la progestérone PR et le récepteur du facteur de croissance épidermique humain HER2[2]. Voici les quatre sous-types de cancer du sein : les tumeurs Luminal A sont caractérisées par la présence de ER et/ou PR et l'absence de HER2, les tumeurs Luminal B sont de grade supérieur et de pire pronostic par rapport à Luminal A, elles sont ER positives et peut être PR négatif et avoir une expression élevée de Ki67 (supérieure à 20 %), le groupe HER2-positif constitue 10 à 15 % des cancers du sein et se caractérise par une expression élevée de HER2 avec absence de ER et PR et cancer du sein triple négatif qui n'ont pas l'expression des trois récepteurs précédents[3][4].

La régulation épigénétique de l'expression des gènes est l'altération de la fonction d'expression des gènes sans modifier la séquence nucléotidique. L’activation et l’inactivation des gènes associés au cancer peuvent se produire par des mécanismes épigénétiques. Les principaux acteurs des mécanismes épigénétiques de régulation des gènes sont la méthylation de l'ADN, la modification des histones, les remodeleurs de la chromatine et l'expression de l'ARN non codant[5].

Les modifications des histones sont l'un des régulateurs importants de la structure de la chromatine, ce qui est très crucial pour l'expression des gènes car elles définissent l'accessibilité de l'ADN aux régulateurs transcriptionnels, affectent l'expression des gènes et influencent les processus cellulaires vitaux [6].

Les modifications des histones peuvent recruter des facteurs de transcription, des remodeleurs de la chromatine et des protéines structurelles de la chromatine, contribuant ainsi à la formation et au maintien d'un état chromatinien actif ou répressif [6]. Les modifications les plus importantes des histones sont : l’acétylation de la lysine, la méthylation de la lysine et de l’arginine, la phosphorylation de la sérine/thréonine/tyrosine et l’ubiquitylation de la sérine/thréonine [6]. De nombreuses enzymes de modification des histones sont fréquemment mutées dans différents types de cancer, par exemple : EHMT2 (G9A) code pour une méthyltransférase qui méthyle les résidus lysine de l'histone H3. La méthylation de H3 au niveau de la lysine 9 par cette protéine entraîne le recrutement de régulateurs épigénétiques supplémentaires et la répression de transcription. L'histone méthyltransférase G9a est bien documentée pour son implication dans la croissance néoplasique [7]. Un autre exemple d'enzymes de modification des histones est KMT5B (SUV420H1), une enzyme méthyl transférase qui catalyse le dépôt de la marque H4k20me, une marque répressive et qui est censée jouer un rôle suppresseur de tumeur dans de nombreux types de cancer [8].

La structure de la chromatine peut également être régulée par les complexes des remodeleurs de la chromatine. Il s'agit de quatre familles conservées de remodeleurs de la chromatine dépendant de l'ATP chez les mammifères (CHD), (ISWI), (INO80) et (SWI/SNF), et sont impliquées dans la plupart des processus cellulaires essentiels [9].

La machinerie de modification de la chromatine est fortement dérégulée dans les cancers, dont le cancer du sein par exemple : des mutations ou une inactivation des gènes codant pour les sous-unités du complexe SWI/SNF sont retrouvées dans environ 20 % des cancers[10].

Un autre mécanisme épigénétique important est l’effet des ARN non codants sur l’expression des gènes.

Les ARN non codants (ARNnc) constituent un groupe hétérogène de transcrits qui ne sont pas traduits en protéines. Ils sont devenus d’importants régulateurs de multiples fonctions biologiques et leur dérégulation a été impliquée dans des maladies, notamment le cancer. Ils ont suscité un énorme intérêt au sein de la communauté scientifique en raison de leur utilisation comme biomarqueurs de maladies. Il existe de nombreux types d’ARNnc, notamment les miARN et les ARNnc[11].

Les microARN (miARN) sont de petites molécules d'ARN non codantes (18-25) hautement conservées, impliquées dans la régulation de l'expression des gènes. De plus en plus d’études ont identifié que les microARN (miARN) sont de nouveaux régulateurs agissant comme suppresseurs de tumeurs ou oncogènes dans la progression tumorale[12]. Il a été rapporté que le miR-138-5p exosomal exerce une fonction oncogène chez les patientes atteintes d'un cancer du sein via l'inhibition de la protéine KDM6B [13]. Peng Bian MD et al ont rapporté que l'expression de miR-4306 serait régulée négativement dans les tissus cancéreux du sein par rapport aux tissus adjacents [14].

Les ARN longs non codants (ARNlnc) sont un autre type d’ARN non codants qui mesurent plus de 200 nucléotides et la plupart d’entre eux ne sont pas traduits en protéines[15]. Bien que la plupart des ARNnc ne soient pas traduits, ils ont suscité un énorme intérêt dans la recherche en raison de leurs fonctions régulatrices sur l'expression génique d'autres gènes cibles[15]. Les LncRNA régulent l'expression des gènes aux niveaux épigénétique, transcriptionnel, post-transcriptionnel, traductionnel et post-traductionnel en interagissant avec l'ARNm, l'ADN, les protéines et les miARN[16]. De plus, ils jouent un rôle crucial dans le maintien des processus biologiques tels que la modification des histones, le remodelage de la chromatine, l’interférence transcriptionnelle, l’activation transcriptionnelle, la traduction de l’ARNm et le traitement de l’ARN[16]. Récemment, il a été déclaré que les ARNnc sont impliqués dans de nombreux cancers tels que le cancer du poumon, le cancer du foie, le cancer de la prostate, le cancer de la vessie et le cancer du sein. Ils peuvent donc être utilisés comme nouveau biomarqueur et cible pharmaceutique dans le traitement du cancer. Par exemple, l’ARNncogène PVT1 favorise la prolifération des cellules cancéreuses du sein via l’axe miR-181a-2-3p/ESR1 (18). Il est important de noter que les ARNnc peuvent avoir une interaction avec les complexes de modification et de remodelage de la chromatine pour réguler étroitement de nombreuses voies cellulaires normales ainsi que des voies cancérigènes. Ils peuvent réguler la machinerie de modification de la chromatine, que ce soit par interaction directe ou indirectement via l'épongage de certains miARN. Exemple d'interaction directe dans le cancer : LncRNA UCA1 régule le remodelage de la chromatine via la liaison avec SMARCA4 pour altérer sa liaison à sa région sur le promoteur p21, ce qui conduit à la prolifération du cancer de la vessie [19]. Exemple d'interaction indirecte dans le cancer : LncRNA-MIAT favorise la progression du cancer de la thyroïde et fonctionne comme un ceRNA pour cibler EZH2 en épongeant miR-150-5p [20].

Les ARNlnc peuvent être détectés dans le plasma/sérum et fonctionnent donc comme un biomarqueur non invasif[21].

LncRNA UPK1A-AS1 est un biomarqueur nouvellement identifié dans le cancer. Il a été rapporté qu'il joue un rôle oncogène dans le cancer du pancréas en conférant une résistance au platine grâce à la réparation des cassures double brin [22]. De plus, il a été déclaré que UPK1A-AS1 favorisait la prolifération du HCC en interagissant avec EZH2 [23]. Malgré le fait que l'ARNnc UPK1A-AS1 aurait été oncogène dans les lignées cellulaires du CHC, du cancer du pancréas et du cancer du poumon, on pensait qu'il avait un rôle suppresseur de tumeur dans le cancer des cellules du carcinome épidermoïde de l'œsophage via l'épongage de miR-1248. 25].

LncRNA UNC5B-AS1 a été reconnu comme un oncogène dans le cancer de la thyroïde, le cancer de la prostate et le CHC[26] [27]. Il a également été déclaré qu'il joue un rôle oncogène dans le cancer de l'ovaire en régulant la modification des histones [28].

Cependant, le rôle des lncRNA UPK1A-AS1 et UNC5B-AS1 dans la pathogenèse des patientes atteintes d'un cancer du sein n'a pas encore été révélé.

1.2. Définition du problème. En Égypte, le cancer du sein est la tumeur maligne la plus courante chez les femmes, la plupart des cas étant diagnostiqués à un stade tardif avec un mauvais pronostic[29]. Environ 46 000 cas incidents sont prévus en 2050. Bien que le taux d'incidence en Égypte soit inférieur aux chiffres mondiaux, le taux de mortalité est beaucoup plus élevé que celui des pays développés, d'environ 2 fois (41 % contre 23 %) [30]. Ainsi, fournir de nouveaux marqueurs pour le diagnostic et/ou le pronostic du cancer du sein ainsi que comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent leur lien avec la carcinogenèse reste un défi dans la gestion et le traitement du cancer du sein.

1.3. Hypothèse. Le problème étant de fournir de nouveaux marqueurs qui n'ont jamais été étudiés chez les patientes atteintes d'un cancer du sein, afin d'aider au diagnostic et au pronostic de cette maladie agressive. En conséquence, dans la présente étude, nous étudierons le rôle des longs ARN non codants UPK1A-AS1 et/ou UNC5B-AS1 en tant que marqueurs diagnostiques et/ou pronostiques possibles dans le cancer du sein. De plus, la diaphonie et la corrélation possibles entre ces longs ARN non codants et les enzymes de modification de la chromatine et/ou les complexes de remodelage comme KMT5B et G9A via l'épongage de certains miARN cibles comme mir-138-5p et mir-4306 seront étudiées. 2. CONSTATS DES ÉTUDES ANTÉRIEURES 2.1. Zhang et coll. ont rapporté que : UPK1A-AS1 favorise le développement du CHC en accélérant la progression du cycle cellulaire grâce à l'interaction avec EZH2 et à l'épongage de miR-138-5p [23].

2.2. Wang et coll. ont rapporté que : UNC5B-AS1 favorisait la progression du cancer de l'ovaire en régulant le H3K27me sur NDRG2 via EZH2 [28].

2.3. Hauang et coll. ont rapporté que : UNC5B-AS1 favorise la prolifération, la migration et l'EMT des cellules de carcinome hépatocellulaire via la régulation de l'axe miR-4306/KDM2A [26].

3. OBJECTIF DU TRAVAIL Estimer les niveaux d'expression de nos lncARN candidats UPK1A-AS1 et/ou UNC5B-AS1 et les corréler avec différents paramètres cliniques chez les patientes atteintes d'un cancer du sein et mettre en lumière leur éventuelle diaphonie avec des protéines modifiant et/ou remodelant la chromatine. comme KMT5B et G9A chez les patientes atteintes d'un cancer du sein via l'épongage de certains miARN cibles comme mir-138-5p et mir-4306.

4. OBJECTIF(S) DE RECHERCHE 4.1. Mesurez l'expression génique des lncRNA UPK1A-AS1 et/ou UNC5B-AS1 et de leurs miARN cibles dans des échantillons de sérum (biopsie liquide) et/ou des échantillons de tissus provenant de patientes atteintes d'un cancer du sein, à l'aide d'une technique quantitative de réaction en chaîne par polymérase en temps réel (qRT-PCR).

4.2. Mesurer le niveau de protéines cibles dans le sérum et/ou les tissus, par ELISA. 4.3. Comparez le niveau d’expression de ces ARNnc aux marqueurs tumoraux protéiques classiques, 4.4. Corréler ces ARNnc et l'axe du niveau de protéine cible aux caractéristiques clinicopathologiques du cancer du sein telles que le stade et le grade de la tumeur, la progression tumorale (TNM) et d'autres biomarqueurs pronostiques clinicopathologiques classiques tels que l'antigène carcinoembryonnaire (CEA), l'antigène du cancer 15-3 (CA15-3). ), (ER), (PR), le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2/neu), le marqueur de prolifération Ki-67 ou PCNA et la formule sanguine complète (CBC), IMC, TA, glycémie et insuline.

5. RÉSULTATS DE LA RECHERCHE 5.1. Primaire. Élucider le rôle de nos lncARN candidats et de leurs cibles en aval obtenues à partir de biopsies liquides et/ou d'échantillons de tissus de patientes atteintes d'un cancer du sein.

5.2. Résultat de publication(s)/visibilité. Article de synthèse + une publication internationale Scopus Q1 traitant des résultats trouvés + présentation des résultats lors d'une conférence internationale de haute réputation.

6. IMPORTANCE DE LA RECHERCHE 6.1. À notre connaissance, il s’agit du premier travail de recherche mesurant le niveau d’expression de UPK1A-AS1 et/ou UNC5B-AS1 dans des échantillons cliniques de cancer du sein.

6.2. Ces données pourraient constituer une approche prometteuse pour l’introduction de nouveaux marqueurs aidant au diagnostic et au pronostic du cancer du sein et constituant des cibles potentielles pour la thérapie génique.

7. MÉTHODOLOGIE DE RECHERCHE 7.1. Analyse bioinformatique 7.1.1. Enquête sur l'expression de nos ARNnc candidats dans des échantillons de cancer du sein à partir d'une analyse interactive de profilage d'expression génique (GEPIA) basée sur les données du Cancer Genome Atlas (TCGA).

7.1.2. Étude des miARN cibles à l'aide d'outils bioinformatiques et/ou d'études expérimentales à l'aide du logiciel en ligne miRcode (//mircode.org/index.php).

7.1.3. Enquête sur les gènes cibles des miARN sélectionnés via les outils en ligne des miARN : miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase ou ENCORI : https://rnasysu.com/encori/ et analyse de cible : https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Analyse de voie ou ontologie de gènes pour la liste des gènes cibles via la base de données enrichr, la liste des gènes cibles a été analysée pour leur relation avec les protéines modifiant et/ou remodelant la chromatine.

8. DÉCLARATION ÉTHIQUE 8.1.1. Cette recherche sera réalisée conformément aux lignes directrices établies par la Déclaration d'Helsinki faisant référence aux lignes directrices éthiques de l'Association médicale mondiale (WMA) pour la recherche médicale sur des sujets humains, initialement publiées en 1964, révisées en 2013 et octobre 2018. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Des échantillons seront collectés après l'annonce du participant et la signature du consentement éclairé.

8.1.2. Approbation éthique et consentement à participer. Cette étude a été approuvée pour la première fois par le Comité d'éthique de la recherche (REC) de la Faculté de pharmacie de l'Université Ain Shams 9. TAILLE DE L'ÉCHANTILLON ET PUISSANCE DE L'ÉTUDE 9.1. La taille estimée de l'échantillon a été calculée à l'aide du calculateur en ligne de taille d'échantillon G power* http://www.gpower.hhu.de/en.html, en utilisant les données d'entrée suivantes : la probabilité d'erreur α est (0,05), la puissance d'étude (0,8). Sur la base des études précédentes menées par Bian et al, 2021 ;Huang et al,2021 ; Tan et coll., 2020 ; Madhvan et al, 2014 [31] [12] [24] [25] qui ont montré une taille d'effet modérée à élevée, une taille d'effet modérée (0,5) a été choisie pour calculer la taille de l'échantillon.

La taille totale de l'échantillon sera de 102 cas, ce nombre sera subdivisé en 2 groupes soit par rapport 50:50, soit par rapport 60:40.

9.2. Conception de l'étude. Étude cas-témoin, rétrospective et monocentrique. 9.3. Participants à l’étude. Une série de patientes égyptiennes atteintes d'un cancer du sein seront recrutées dans l'unité du cancer du sein, département d'oncologie clinique, Université Ain Shams, Le Caire, Égypte.

Groupe 1 ; les patientes atteintes d'un cancer du sein malin non métastatique ; patientes nouvellement diagnostiquées d’un cancer du sein.

Groupe 2 ; groupe témoin ; volontaires sains. 9.3.1Clinico-pathologique Critères. Données cliniques obtenues à partir des dossiers médicaux et des rapports de pathologie originaux. Ces données doivent être compilées dans un fichier Excel détaillé.

Les données cliniques suivantes doivent être enregistrées et évaluées comme dans le fichier Excel ci-joint.

• Les antécédents familiaux complets seront enregistrés pour tous les participants atteints d'un cancer du sein.
• Antécédents individuels de cancer et évaluation clinique de la tumeur réalisée à l'aide de la classification (TNM) de l'American Joint Committee on Cancer (AJCC).
• L'échelle Bloom-Richardson sera utilisée pour le classement histologique.
• Les caractéristiques des patientes atteintes d'un cancer du sein en ce qui concerne l'indice de masse corporelle (IMC), la CBC, l'état ménopausique, les types histopathologiques du cancer du sein ; carcinome canalaire invasif (IDC) et carcinome lobulaire invasif (ILC). Classifications moléculaires du cancer du sein luminal A, B, cancer du sein triple négatif.
• Taille de la tumeur, ainsi que les données des biomarqueurs clinico-pathologiques CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 ou PCNA (le cas échéant) seront collectées à partir des dossiers des patients pour des corrélations et des analyses statistiques plus approfondies.

9.3.2. Critères d'inclusion ; Patientes égyptiennes atteintes d'un cancer du sein âgées de 18 ans et plus, nouvellement diagnostiquées avec un cancer du sein.

9.3.3 Critères d'exclusion ; maladies du sang, tout cancer autre que le cancer du sein, la cirrhose du foie et les maladies de l'utérus et de la vessie ou les patientes atteintes d'un cancer du sein présentant des signes de métastases à distance.

9.4. Prélèvement de sang : 6 ml de sang périphérique seront collectés dans des vacutainers en gel polymère avec activateur de caillot (Greiner Bio-One GmbH, Australie), laissés pendant 15 min. à température ambiante pour coaguler, suivi de 10 min. centrifugation à 10 000 g à 4°C, les sérums obtenus seront aliquotés dans 5 tubes Eppendorf propres et conservés à -80°C, jusqu'à l'évaluation biochimique au Département de Biochimie, Faculté de Pharmacie, Université d'Ain-Shams.

9.4.1 Les sérums stockés seront utilisés pour les mesures par technique ELISA des niveaux de protéines cibles, à l'aide de kits ELISA disponibles dans le commerce, conformément aux instructions du fabricant.

9.4.2. L'ARN génomique sera extrait ; Extraction des ARNnc à partir d’échantillons de sérum et évaluation de la purification. Quantification du niveau d’expression des ARNnc, à l’aide de qRT-PCR par étape un plus. Nous procéderons à l'extraction totale de l'ARN de l'échantillon de sérum à l'aide du miRNeasy Mini Kit. La synthèse de l'ADNc se fera ensuite à l'aide du kit de synthèse de l'ADNc VERSO (Thermo Scientific, USA).

Ensuite, nous effectuerons des analyses quantitatives de PCR en temps réel (qRT-PCR) en utilisant le master mix sybr green PCR (Thermo Scientific, USA) et des amorces spécifiques conçues pour les ARNc cibles ainsi que le gène de référence domestique.

10. ANALYSE STATISTIQUE 10.1. Les données seront collectées, tabulées sur Excel, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) version 20, sera le programme utilisé ou Stat4 ou Graphpad Prism pour les figures, 10.3. La normalité des données sera testée par la calculatrice Shapiro-Wilk, 10.3.1. Les variables normalement distribuées doivent être exprimées sous forme de moyenne + (S.E.M) et analysées à l'aide de deux échantillons indépendants. Le test t et l'ANOVA doivent être utilisés pour la comparaison de 2 groupes ou plus, s'ils sont normalement distribués, respectivement.

10.3.2. Ajustement et normalisation des facteurs de confusion tels que l'âge et l'IMC, .. entre le contrôle et les patients ainsi que l'analyse de régression multiple ou ANCOVA pour prédire un facteur de confusion, 10.3.3. Les données doivent être présentées comme médianes (plage), si elles ne sont pas normalement distribuées, Mann-Whitney (U) ou Kruskal-Wallis (H) seront effectuées pour comparer entre deux ou plusieurs groupes indépendants, respectivement, 10.4. Les valeurs P étaient bilatérales et considérées comme significatives si P <0,05,11.