"A kulcsfontosságú epigenetikai közvetítők szerepének tanulmányozása emlőrákos betegekben"

Az emlőrákot világszerte az egyik leggyakoribb rosszindulatú daganatos megbetegedésnek tekintik a nők körében, és a nők körében világszerte az egyik vezető halálok. A mellrákos betegek prognózisa a diagnózis és a terápia jelentős előrehaladása ellenére továbbra is kiábrándító [1][2]. Az emlőrák egy rendkívül heterogén betegség, amely bizonyos hormonális receptorok expressziója alapján négy altípusba sorolható: ösztrogén receptor ER, progeszteron receptor PR és humán epidermális növekedési faktor receptor HER2[2]. Az emlőrák négy altípusa a következő: A Luminal A daganatokra jellemző az ER és/vagy PR jelenléte és a HER2 hiánya, a Luminal B daganatok magasabb fokúak és rosszabb prognózisúak a Luminal A-hoz képest, ER pozitívak, ill. PR-negatív lehet és magas Ki67 expresszióval rendelkezik (több mint 20%), a HER2-pozitív csoport az emlőrákok 10-15%-át teszi ki, és magas HER2 expresszió ER és PR hiányával, valamint hármas negatív emlőrák, amelyekből hiányzik az előző három receptor expressziója[3][4].

A génexpresszió epigenetikai szabályozása a génexpressziós funkció megváltoztatása a nukleotidszekvencia megváltoztatása nélkül. A rákkal kapcsolatos gének aktiválása és inaktiválása egyaránt előfordulhat epigenetikai mechanizmusok révén. A génszabályozás epigenetikai mechanizmusainak főbb szereplői a DNS-metiláció, a hisztonmódosítás, a kromatin-remodellerek és a nem kódoló RNS-expresszió[5].

A hiszton módosulások a kromatin szerkezetének egyik fontos szabályozója, amely nagyon fontos a génexpresszió szempontjából, mivel meghatározza a DNS hozzáférhetőségét a transzkripciós szabályozók számára, befolyásolja a génexpressziót és befolyásolja a létfontosságú sejtfolyamatokat [6].

A hisztonmódosítások transzkripciós faktorokat, kromatin-remodellereket és kromatin szerkezeti fehérjéket toborozhatnak, így hozzájárulhatnak az aktív vagy represszív kromatin állapot kialakulásához és fenntartásához[6]. A legfontosabb hisztonmódosítások a következők: lizin acetilezés, lizin és arginin metilezése, szerin/treonin/tirozin foszforiláció és szerin/treonin ubiquitiláció [6]. A hisztonmódosító enzimek közül sok gyakran mutációt mutat különböző ráktípusokban, például: az EHMT2 (G9A) egy metiltranszferázt kódol, amely a H3 hiszton lizin-maradékait metilálja, a H3 metilezése a lizin 9-nél ezzel a fehérjével további epigenetikai szabályozók felvételét és a rák elnyomását eredményezi. átírása. A hiszton metiltranszferáz G9a jól dokumentált a neoplasztikus növekedésben való szerepe tekintetében[7]. Egy másik példa a hisztonmódosító enzimekre a KMT5B (SUV420H1), egy metil-transzferáz enzim, amely katalizálja a H4k20me jel lerakódását, egy represszív jelet, és vélhetően tumorszuppresszor szerepet játszik számos ráktípusban[8].

A kromatin szerkezetét a kromatin-remodellerek komplexei is szabályozhatják, ezek az ATP-függő kromatin-remodellerek négy konzervált családja emlősökben (CHD), (ISWI), (INO80) és (SWI/SNF), és a legtöbb esetben részt vesznek. esszenciális sejtfolyamatok [9].

A kromatin módosító gépezet erősen szabályozatlan a rákos megbetegedések, köztük az emlőrák esetében, például: az SWI/SNF-komplex alegységeit kódoló gének mutációi vagy inaktiválása a rákos megbetegedések körülbelül 20%-ában fordul elő[10].

Egy másik fontos epigenetikai mechanizmus a nem kódoló RNS-ek hatása a génexpresszióra.

A nem kódoló RNS-ek (ncRNS-ek) a transzkriptumok heterogén csoportja, amelyek nem transzlálódnak fehérjékké. Számos biológiai funkció fontos szabályozójaként jelentek meg, és diszregulációjuk szerepet játszik olyan betegségekben, mint a rák. Óriási érdeklődésre tettek szert a tudományos közösség körében, mivel betegségek biomarkereként használják őket. Sokféle ncRNS létezik, beleértve a miRNS-eket és az lncRNS-eket[11].

A mikroRNS-ek (miRNS-ek) kicsi, erősen konzervált, nem kódoló RNS-molekulák (18-25) nukleotidok, amelyek a génexpresszió szabályozásában vesznek részt. A felhalmozódó vizsgálatok kimutatták, hogy a mikroRNS-ek (miRNS-ek) új szabályozók, amelyek tumorszuppresszorként vagy onkogénként működnek a tumor progressziójában[12]. Beszámoltak arról, hogy az exoszomális miR-138-5p onkogén funkciót fejt ki emlőrákos betegekben a KDM6B fehérje gátlásán keresztül[13]. Peng Bian MD és munkatársai arról számoltak be, hogy a miR-4306 expressziójáról számoltak be, hogy az emlőrákos szövetekben a szomszédos szövetekkel összehasonlítva csökkent [14].

A hosszú, nem kódoló RNS-ek (lncRNS-ek) a nem kódoló RNS-ek egy másik típusa, amelyek több mint 200 nukleotid hosszúak, és legtöbbjük nem transzlálódik fehérjékké[15]. Annak ellenére, hogy a legtöbb lncRNS-t nem fordítják le, hatalmas érdeklődést váltottak ki a kutatásban, mivel szabályozó funkcióik vannak más célgének génexpressziójára vonatkozóan[15]. Az LncRNS-ek szabályozzák a génexpressziót epigenetikai, transzkripciós, poszttranszkripciós, transzlációs és poszttranszlációs szinten az mRNS-sel, DNS-sel, fehérjével és miRNS-sel való kölcsönhatás révén[16]. Emellett kulcsfontosságú szerepük van a biológiai folyamatok fenntartásában, mint például a hisztonmódosítás, a kromatin-átalakítás, a transzkripciós interferencia, a transzkripciós aktiválás, az mRNS-transzláció és az RNS-feldolgozás[16]. A közelmúltban megállapították, hogy az lncRNS-ek számos rákbetegségben, például tüdőrákban, májrákban, prosztatarákban, húgyhólyagrákban és emlőrákban szerepet játszanak[2], így új biomarkerként és gyógyszerészeti célpontként használhatók a rákterápiában [17]. Például az onkogén lncRNS PVT1 elősegíti az emlőráksejtek proliferációját a miR-181a-2-3p/ESR1 tengelyen keresztül [18]. Fontos, hogy az lncRNS-ek áthallásban lehetnek a kromatint módosító és átalakító komplexekkel, hogy szorosan szabályozzák számos normál sejtútvonalat, valamint rákkeltő útvonalakat. Szabályozhatják a kromatin-módosító gépezetet akár közvetlen kölcsönhatás révén, akár közvetetten bizonyos miRNS-ek szivacsozásán keresztül. Példa közvetlen kölcsönhatásra rákban: Az LncRNS UCA1 szabályozza a kromatin átalakulását a SMARCA4-hez való kötődésen keresztül, hogy csökkentse annak kötődését a p21 promoter régiójához, ami a húgyhólyagrák proliferációjához vezet[19]. Példa közvetett kölcsönhatásra rákban: Az LncRNA-MIAT elősegíti a pajzsmirigyrák progresszióját, és ceRNS-ként működik, hogy megcélozza az EZH2-t a miR-150-5p-vel [20].

Az LncRNS-ek kimutathatók a plazmában/szérumban, így non-invazív biomarkerként funkcionálnak[21].

Az LncRNA UPK1A-AS1 egy újonnan azonosított biomarker a rákban. Beszámoltak arról, hogy onkogén szerepet játszik a hasnyálmirigyrákban, mivel platina rezisztenciát biztosít a kettős száltörés javítása révén[22]. Ezenkívül azt állították, hogy az UPK1A-AS1 elősegítette a HCC elszaporodását azáltal, hogy kölcsönhatásba lép az EZH2-vel[23]. Annak ellenére, hogy az lncRNS UPK1A-AS1 onkogén hatású a HCC-ben, a hasnyálmirigyrákban és a tüdőrák sejtvonalakban, úgy vélték, hogy a nyelőcső laphámsejtes karcinóma sejtrákjában a miR-1248 spongingon keresztül tumorszuppresszor szerepet játszik[24][24][ 25].

Az LncRNS UNC5B-AS1-et onkogénként ismerték fel pajzsmirigyrákban, prosztatarákban és HCC-ben[26] [27]. Azt is megállapították, hogy onkogén szerepet játszik a petefészekrákban a hisztonmódosítás szabályozásán keresztül[28].

Az lncRNS-ek UPK1A-AS1 és UNC5B-AS1 szerepét azonban az emlőrákos betegek patogenezisében még nem tárták fel.

1.2. Probléma meghatározása. Egyiptomban a mellrák a leggyakoribb rosszindulatú daganat a nők körében, és az esetek többségét késői stádiumban, rossz prognózissal diagnosztizálják[29]. Az előrejelzések szerint 2050-ben körülbelül 46 000 incidens várható. Bár az egyiptomi előfordulási arány alacsonyabb, mint a globális adatok, a halálozási ráta a fejlett országokhoz képest körülbelül 2-szerese (41% vs 23%) [30]. Így az emlőrák diagnózisához és/vagy prognózisához szükséges új markerek biztosítása, valamint a karcinogenezissel való kapcsolatuk mögött meghúzódó molekuláris mechanizmusok megértése továbbra is kihívást jelent az emlőrák kezelésében és kezelésében.

1.3. Hipotézis. Mivel a problémafelvetés az, hogy olyan új markereket biztosítsunk, amelyeket korábban nem vizsgáltak emlőrákos betegeknél, hogy segítsenek ennek az agresszív betegségnek a diagnosztizálásában és prognózisában. Ennek megfelelően jelen tanulmányban megvizsgáljuk a hosszú, nem kódoló UPK1A-AS1 és/vagy UNC5B-AS1 RNS-ek, mint lehetséges diagnosztikai és/vagy prognosztikai markerek szerepét az emlőrákban. Ezen túlmenően megvizsgáljuk a lehetséges áthallást és korrelációt ezen hosszú, nem kódoló RNS-ek és a kromatin módosító enzimek és/vagy a KMT5B és a G9A átmodellező komplexei között bizonyos célmiRNS-ek, például mir-138-5p és mir-4306 szivacsos áthaladásán keresztül. 2. KORÁBBI TANULMÁNYOK MEGÁLLAPÍTÁSAI 2.1. Zhang és mtsai. beszámolt arról, hogy: Az UPK1A-AS1 elősegíti a HCC fejlődését azáltal, hogy felgyorsítja a sejtciklus progresszióját az EZH2-vel való kölcsönhatás és a miR-138-5p felszaporodása révén [23].

2.2. Wang és mtsai. beszámolt arról, hogy: Az UNC5B-AS1 elősegítette a petefészekrák progresszióját az NDRG2-n lévő H3K27me szabályozásával az EZH2-n keresztül[28].

2.3. Hauang et al. beszámolt arról, hogy: Az UNC5B-AS1 elősegíti a hepatocelluláris karcinóma sejtek proliferációját, migrációját és EMT-jét a miR-4306/KDM2A tengely szabályozásán keresztül[26].

3. CÉLKITŰZÉS A jelölt lncRNS-eink UPK1A-AS1 és/vagy UNC5B-AS1 expressziós szintjének becslése és összefüggésbe hozása a különböző klinikai paraméterekkel emlőrákos betegekben, valamint rávilágítani a kromatint módosító és/vagy átalakító fehérjékkel való lehetséges áthallásukra. mint KMT5B és G9A emlőrákos betegekben bizonyos cél-miRNS-ek, mint mir-138-5p és mir-4306.

4. KUTATÁSI CÉLKITŰZÉS(EK) 4.1. Mérje meg az lncRNS UPK1A-AS1 és/vagy UNC5B-AS1 és célmiRNS-ek génexpresszióját mellrákos betegek szérummintáiban (folyékony biopszia) és/vagy szövetmintáiban kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakciós technikával (qRT-PCR).

4.2. Mérje meg a szérum és/vagy szöveti célfehérjék szintjét ELISA-val. 4.3. Hasonlítsa össze ezeket az ncRNS-ek expressziós szintjét a klasszikus protein tumormarkerekkel, 4.4. Kapcsolja össze ezeket az ncRNS-eket és a célfehérje szinttengelyt az emlőrák klinikopatológiai jellemzőivel, mint a tumor stádiuma és fokozata, a tumor progressziója (TNM) és más klasszikus klinikopatológiai prognosztikai biomarkerekkel, mint például a karcinoembrionális antigén (CEA), a rák antigén 15-3 (CA15-3). ), (ER), (PR), humán epidermális növekedési faktor receptor 2 (HER2/neu), a proliferációs marker Ki-67 vagy PCNA és teljes vérkép (CBC), BMI, BP, vércukorszint és inzulin.

5. A KUTATÁS EREDMÉNYEI 5.1. Elsődleges. Tisztázza a jelölt lncRNS-eink szerepét és a mellrákos betegek folyékony biopsziájából és/vagy szövetmintáiból nyert downstream célpontjaikat.

5.2. Kiadvány(ok)/Láthatósági eredmény. Áttekintő cikk + egy nemzetközi Scopus Q1 publikáció, amely a talált eredményekkel foglalkozik + egy nemzetközi jó hírű konferencia eredményeinek bemutatása.

6. A KUTATÁS JELENTŐSÉGE 6.1. Legjobb tudomásunk szerint ez az első olyan kutatási munka, amely az UPK1A-AS1 és/vagy UNC5B-AS1 expressziós szintjét méri emlőrák klinikai mintákban.

6.2. Ezek az adatok ígéretes megközelítést jelenthetnek egy új markerek bevezetésében, amelyek segítenek az emlőrák diagnosztizálásában és prognózisában, és potenciális célpontokat jelentenek a génterápia számára.

7. A KUTATÁS MÓDSZERTANA 7.1. Bioinformatikai elemzés 7.1.1. A jelölt lncRNS-ek expressziójának vizsgálata mellrák mintákban génexpressziós profilozó interaktív analízis (GEPIA) segítségével a The Cancer Genome Atlas adatok (TCGA) adatai alapján.

7.1.2. Cél miRNS-ek vizsgálata bioinformatikai eszközökkel és/vagy kísérleti tanulmányokkal a miRcode online szoftverrel (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. A kiválasztott miRNS-ek célgének vizsgálata miRNS online eszközökkel: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase vagy ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ és célvizsgálat: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Útvonal-analízis vagy Gene Ontology a célgének listájához enrichr adatbázison keresztül, a célgének listáját a kromatint módosító és/vagy átalakító fehérjékkel való kapcsolatuk szempontjából elemeztük.

8. ETIKAI NYILATKOZAT 8.1.1. Ezt a kutatást a Helsinki Nyilatkozatban meghatározott irányelvekkel összhangban végzik el, hivatkozva az Orvosi Világszövetség (WMA) emberi alanyokkal végzett orvosi kutatásra vonatkozó, eredetileg 1964-ben közzétett, 2013-ban és 2018 októberében felülvizsgált etikai irányelveire. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

A minták gyűjtése a résztvevő bejelentése és a beleegyező nyilatkozat aláírása után történik.

8.1.2. Etikai jóváhagyás és hozzájárulás a részvételhez. Ezt a tanulmányt először az Ain Shams Egyetem Gyógyszerésztudományi Karának Kutatási Etikai Bizottsága (REC) hagyta jóvá. 9. A MINTA MÉRETE ÉS A VIZSGÁLAT EREDMÉNYE 9.1. A becsült mintaméretet a G power* mintaméret online számológépe számította ki: http://www.gpower.hhu.de/en.html, a következő bemeneti adatok felhasználásával: α hibavalószínűség (0,05), a vizsgálat hatványa (0,8). Bian és munkatársai által végzett korábbi tanulmányok alapján, 2021; Huang és mtsai, 2021; Tan és mtsai, 2020; Madhvan és mtsai, 2014 [31] [12] [24] [25], amelyek közepestől nagyig terjedő hatásméretet mutattak, a minta méretének kiszámításához közepes hatásméretet (0,5) választottunk.

A teljes mintanagyság 102 eset lesz, ezt a számot 2 csoportra osztjuk 50:50 vagy 60:40 arány szerint.

9.2. Tanulmánytervezés. Esetkontrollos, retrospektív, monocentrikus vizsgálat. 9.3. A tanulmány résztvevői. A kairói Ain Shams Egyetem Klinikai Onkológiai Osztályának Mellrák Osztályáról egy sor egyiptomi női mellrákos beteget toboroznak.

1. csoport; rosszindulatú, nem áttétes emlőrákos betegek; újonnan diagnosztizált emlőrákos betegek.

2. csoport; kontrollcsoport; egészséges önkéntesek. 9.3.1 Klinikai-patológiai Kritériumok. Az orvosi feljegyzésekből és az eredeti patológiai jelentésekből származó klinikai adatok. Ezeket az adatokat egy részletes Excel fájlba kell összeállítani.

A következő klinikai adatokat kell rögzíteni és értékelni a mellékelt excel fájl szerint.

• A teljes családi anamnézis minden emlőrákos résztvevő esetében rögzítésre kerül.
• Egyéni ráktörténet és a tumor klinikai értékelése az American Joint Committee on Cancer (AJCC) (TNM) osztályozása alapján.
• A szövettani osztályozáshoz a Bloom-Richardson skálát fogják használni.
• Az emlőrákos betegek jellemzői a testtömegindex (BMI), CBC, menopauzális állapot, emlőrák kórszövettani típusai tekintetében; invazív duktális karcinóma (IDC) és invazív lobuláris karcinóma (ILC). A mellrák molekuláris osztályozása luminális A, B, tripla negatív emlőrák.
• A tumorméret, valamint a klinikai-patológiai biomarkerek CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 vagy PCNA (ha vannak ilyenek) adatait a betegállományokból gyűjtik össze további összefüggések és statisztikai elemzés céljából.

9.3.2. Befogadási kritériumok; 18 éves és idősebb egyiptomi emlőrákos nők, akiknél újonnan diagnosztizáltak mellrákot.

9.3.3 Kizárási kritériumok; vérbetegségek, az emlőrákon kívüli bármilyen rák, májcirrózis, méh- és húgyhólyag-betegségek vagy mellrákos betegek, akiknél távoli áttétek bármilyen bizonyítéka mutatkozik.

9.4. Vérmintavétel: 6 ml perifériás vért 15 percig állni hagyva, alvadékaktivátorral (Greiner Bio-One GmbH, Ausztrália) ellátott polimer gél vakutainerekbe gyűjtünk. szobahőmérsékleten, hogy megalvadjon, majd 10 perc. centrifugálással 10 000 g-vel 4 °C-on, a kapott szérumot 5 tiszta Eppendorf-csőbe aliquot részekre osztják, és -80 °C-on tárolják a biokémiai értékelésig az Ain-Shams Egyetem Gyógyszerészeti Karának Biokémiai Tanszékén.

9.4.1 Tárolt szérumokat használnak a célfehérjeszintek ELISA technikával történő mérésére, a kereskedelemben kapható ELISA készletek felhasználásával a gyártó utasításainak megfelelően.

9.4.2. A genomi RNS-t kivonják; ncRNS-ek kivonása szérummintákból és tisztítási értékelés. ncRNS-ek expressziós szintjének kvantifikálása, qRT-PCR használatával az első lépésben plusz. Folytatjuk a teljes RNS extrakciót a szérummintából a miRNeasy Mini Kit segítségével. A c-DNS szintézis ezt követően történik a VERSO c-DNS szintézis készlettel (Thermo Scientific, USA).

Ezt követően kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR) elemzéseket végzünk sybr green PCR master mix (Thermo Scientific, USA) és a cél ncRNS-ekhez tervezett specifikus primerek, valamint a housekeeping referenciagén felhasználásával.

10. STATISZTIKAI ELEMZÉS 10.1. Az adatokat összegyűjtjük, excel táblázatos formában, 10.2. Az SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) 20-as verziója lesz a használt program, vagy Stat4 vagy Graphpad Prism az ábrákhoz, 10.3. Az adatok normálisságát Shapiro-Wilk számológéppel teszteljük, 10.3.1. A normál eloszlású változókat átlag+(S.E.M) formában kell kifejezni, és két mintával kell elemezni, független tanulók t-tesztjét és ANOVA-t kell használni 2 vagy több csoport összehasonlításához, ha normális eloszlásúak.

10.3.2. Korrekció és normalizálás a zavaró tényezőkre, mint az életkor és a BMI, .. a kontroll és a betegek között, valamint többszörös regressziós elemzés vagy ANCOVA a zavaró tényező előrejelzésére, 10.3.3. Az adatokat mediánként (Tartományként) kell bemutatni, ha nem normális eloszlású, akkor Mann-Whitney (U) vagy Kruskal-Wallis (H) módszerrel kell összehasonlítani két vagy több független csoportot. 10.4. A P-értékek kétirányúak, és akkor tekinthetők szignifikánsnak, ha P <0,05,11.