"Estudiar el papel de los mediadores epigenéticos clave en pacientes con cáncer de mama"

El cáncer de mama se considera una de las neoplasias malignas más frecuentes en las mujeres en todo el mundo y una de las principales causas de muerte entre las mujeres a nivel mundial. Incluso con avances notables en el diagnóstico y la terapia, el pronóstico de las pacientes con cáncer de mama sigue siendo decepcionante[1][2]. El cáncer de mama es una enfermedad muy heterogénea que se clasifica en cuatro subtipos en función de la expresión de ciertos receptores hormonales como el receptor de estrógeno ER, el receptor de progesterona PR y el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano HER2[2]. Los siguientes son los cuatro subtipos de cáncer de mama: Los tumores luminales A se caracterizan por la presencia de ER y/o PR y la ausencia de HER2, los tumores luminales B son de mayor grado y peor pronóstico en comparación con los luminal A, son ER positivos y puede ser PR negativo y tener una alta expresión de Ki67 (más del 20%), el grupo HER2 positivo constituye del 10 al 15 % de los cánceres de mama y se caracteriza por una alta expresión de HER2 con ausencia de ER y PR y cáncer de mama triple negativo que carecen de la expresión de los tres receptores anteriores[3][4].

La regulación epigenética de la expresión génica es la alteración en la función de expresión génica sin cambiar la secuencia de nucleótidos. Tanto la activación como la inactivación de genes asociados al cáncer pueden ocurrir mediante mecanismos epigenéticos. Los principales actores en los mecanismos epigenéticos de regulación genética son la metilación del ADN, la modificación de histonas, los remodeladores de la cromatina y la expresión del ARN no codificante [5].

Las modificaciones de histonas son uno de los reguladores importantes de la estructura de la cromatina, que es muy crucial para la expresión génica, ya que define la accesibilidad del ADN para los reguladores transcripcionales, afecta la expresión génica e influye en los procesos celulares vitales [6].

Las modificaciones de las histonas pueden reclutar factores de transcripción, remodeladores de la cromatina y proteínas estructurales de la cromatina, por lo que contribuyen a la formación y mantenimiento del estado de cromatina activa o represiva [6]. Las modificaciones de histonas más importantes son: acetilación de lisina, metilación de lisina y arginina, fosforilación de serina/treonina/tirosina y ubiquitilación de serina/treonina [6]. Muchas de las enzimas de modificación de histonas frecuentemente mutan en diferentes tipos de cáncer, por ejemplo: EHMT2 (G9A) codifica una metiltransferasa que metila los residuos de lisina de la histona H3. La metilación de H3 en la lisina 9 por esta proteína da como resultado el reclutamiento de reguladores epigenéticos adicionales y la represión de transcripción. La histona metiltransferasa G9a está bien documentada por su implicación en el crecimiento neoplásico [7]. Otro ejemplo de enzimas de modificación de histonas es la KMT5B (SUV420H1), una enzima metil transferasa que cataliza la deposición de la marca H4k20me, una marca represiva y se cree que tiene un papel supresor de tumores en muchos tipos de cáncer [8].

La estructura de la cromatina también puede ser regulada por complejos de remodeladores de cromatina, son cuatro familias conservadas de remodeladores de cromatina dependientes de ATP en mamíferos (CHD), (ISWI), (INO80) y (SWI/SNF), y están involucrados en la mayoría procesos celulares esenciales [9].

La maquinaria de modificación de la cromatina está altamente desregulada en los cánceres, incluido el cáncer de mama, por ejemplo: mutaciones o inactivación de genes que codifican subunidades del complejo SWI/SNF se encuentran en aproximadamente el 20% de los cánceres [10].

Otro mecanismo epigenético importante es el efecto de los ARN no codificantes sobre la expresión genética.

Los ARN no codificantes (ncRNA) son un grupo heterogéneo de transcritos que no se traducen en proteínas. Se han convertido en importantes reguladores de múltiples funciones biológicas y su desregulación se ha relacionado con enfermedades como el cáncer. Han despertado un gran interés entre la comunidad científica debido a su uso como biomarcadores de enfermedades. Hay muchos tipos de ncRNA, incluidos miRNA y lncRNA [11].

Los microARN (miARN) son moléculas de ARN no codificantes (18-25) nucleótidos pequeñas y altamente conservadas implicadas en la regulación de la expresión génica. Los estudios acumulados han identificado que los microARN (miARN) son reguladores novedosos que actúan como supresores de tumores u oncogenes en la progresión tumoral [12]. Se informó que el miR-138-5p exosomal ejerce una función oncogénica en pacientes con cáncer de mama mediante la inhibición de la proteína KDM6B [13]. Peng Bian MD et al informaron que se informó que la expresión de miR-4306 estaba regulada negativamente en los tejidos de cáncer de mama en comparación con los tejidos adyacentes [14].

Los ARN largos no codificantes (lncRNA) son otro tipo de ARN no codificantes que tienen más de 200 nucleótidos de longitud y la mayoría de ellos no se traducen en proteínas [15]. A pesar de que la mayoría de los lncRNA no están traducidos, han ganado un gran interés en la investigación debido a sus funciones reguladoras de la expresión génica de otros genes diana[15]. Los LncRNA regulan la expresión génica a nivel epigenético, transcripcional, postranscripcional, traduccional y postraduccional al interactuar con ARNm, ADN, proteínas y miARN [16]. Además, tienen un papel crucial en el mantenimiento de procesos biológicos como la modificación de histonas, la remodelación de la cromatina, la interferencia transcripcional, la activación transcripcional, la traducción de ARNm y el procesamiento de ARN[16]. Recientemente se afirmó que los lncRNA están involucrados en muchos cánceres como el cáncer de pulmón, el cáncer de hígado, el cáncer de próstata, el cáncer de vejiga y el cáncer de mama [2], por lo que pueden usarse como un nuevo biomarcador y un objetivo farmacéutico en la terapia del cáncer [17]. Por ejemplo, el ARNc oncogénico PVT1 promueve la proliferación de células de cáncer de mama a través del eje miR-181a-2-3p/ESR1 [18]. Es importante destacar que los lncRNA pueden tener una interacción con complejos de modificación y remodelación de la cromatina para regular estrechamente muchas vías celulares normales, así como vías cancerígenas. Pueden regular la maquinaria de modificación de la cromatina, ya sea mediante interacción directa o indirectamente mediante la esponjación de ciertos miARN. Ejemplo de interacción directa en el cáncer: LncRNA UCA1 regula la remodelación de la cromatina mediante la unión con SMARCA4 para alterar su unión a su región en el promotor p21, lo que conduce a la proliferación del cáncer de vejiga [19]. Ejemplo de interacción indirecta en el cáncer: LncRNA-MIAT promueve la progresión del cáncer de tiroides y funciona como ARNce para apuntar a EZH2 al esponjar miR-150-5p [20].

Los LncRNA se pueden detectar en plasma/suero, por lo que funcionan como biomarcadores no invasivos [21].

LncRNA UPK1A-AS1 es un biomarcador recientemente identificado en el cáncer. Se informó que tiene un papel oncogénico en el cáncer de páncreas al conferir resistencia al platino mediante la reparación de roturas de doble cadena [22]. Además, se afirmó que UPK1A-AS1 promovió la proliferación de HCC al interactuar con EZH2 [23]. A pesar de que se informó que el lncRNA UPK1A-AS1 era oncogénico en líneas celulares de CHC, cáncer de páncreas y cáncer de pulmón, se creía que tenía un papel supresor de tumores en el cáncer de células de carcinoma de células escamosas de esófago a través de la esponja miR-1248[24][ 25].

LncRNA UNC5B-AS1 ha sido reconocido como un oncogén en el cáncer de tiroides, cáncer de próstata y CHC [26] [27]. También se afirmó que tiene un papel oncogénico en el cáncer de ovario mediante la regulación de la modificación de las histonas [28].

Sin embargo, aún no se ha revelado el papel de los lncRNA UPK1A-AS1 y UNC5B-AS1 en la patogénesis de los pacientes con cáncer de mama.

1.2. Definición del problema. En Egipto, el cáncer de mama es la neoplasia maligna más común entre las mujeres y la mayoría de los casos se diagnostican en una etapa tardía con mal pronóstico [29]. Se pronostican aproximadamente 46.000 casos incidentes en 2050. Aunque la tasa de incidencia en Egipto es inferior a las cifras mundiales, la tasa de mortalidad es mucho mayor si se compara con la de los países desarrollados en aproximadamente 2 veces (41% frente a 23%) [30]. Por lo tanto, proporcionar nuevos marcadores para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de mama, así como comprender los mecanismos moleculares subyacentes a su vínculo con la carcinogénesis, sigue siendo un desafío en el manejo y tratamiento del cáncer de mama.

1.3. Hipótesis. El planteamiento del problema es proporcionar marcadores novedosos que no se hayan estudiado antes en pacientes con cáncer de mama para ayudar en el diagnóstico y pronóstico de esta agresiva enfermedad. En consecuencia, en el presente estudio investigaremos el papel de los ARN largos no codificantes UPK1A-AS1 y/o UNC5B-AS1 como posibles marcadores de diagnóstico y/o pronóstico en el cáncer de mama. Además, se investigará la posible interferencia y correlación entre estos ARN largos no codificantes y las enzimas de modificación de la cromatina y/o complejos de remodelación como KMT5B y G9A mediante la esponja de ciertos miARN objetivo como mir-138-5p y mir-4306. 2. RESULTADOS DE ESTUDIOS ANTERIORES 2.1. Zhang et al. informó que: UPK1A-AS1 promueve el desarrollo de HCC al acelerar la progresión del ciclo celular mediante la interacción con EZH2 y la esponjación de miR-138-5p [23].

2.2. Wang y cols. informó que: UNC5B-AS1 promovió la progresión del cáncer de ovario al regular el H3K27me en NDRG2 a través de EZH2 [28].

2.3. Hauang et al. informó que: UNC5B-AS1 promueve la proliferación, migración y EMT de células de carcinoma hepatocelular mediante la regulación del eje miR-4306/KDM2A [26].

3. OBJETIVO DEL TRABAJO Estimar los niveles de expresión de nuestros lncRNAs candidatos UPK1A-AS1 y/o UNC5B-AS1 y correlacionarlos con diferentes parámetros clínicos en pacientes con cáncer de mama y arrojar luz sobre su posible interferencia con proteínas modificadoras y/o remodeladoras de la cromatina. como KMT5B y G9A en pacientes con cáncer de mama mediante la esponja de ciertos miARN objetivo como mir-138-5p y mir-4306.

4. OBJETIVO(S) DE INVESTIGACIÓN 4.1. Mida la expresión del gen lncRNA UPK1A-AS1 y/o UNC5B-AS1 y sus miRNA diana en muestras de suero (biopsia líquida) y/o muestras de tejido de pacientes con cáncer de mama, utilizando la técnica cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR).

4.2. Medir el nivel de proteínas diana en suero y/o tejido, mediante ELISA. 4.3. Compare el nivel de expresión de estos ncRNA con los marcadores tumorales proteicos clásicos, 4.4. Correlacione estos ncRNA y el eje del nivel de proteína diana con las características clínico-patológicas del cáncer de mama como estadio y grado del tumor, progresión del tumor (TNM) y otros biomarcadores de pronóstico clínico-patológico clásicos, como el antígeno carcinoembrionario (CEA), el antígeno del cáncer 15-3 (CA15-3). ), (ER), (PR), el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2/neu), el marcador de proliferación Ki-67 o PCNA y el hemograma completo (CBC), IMC, PA, nivel de glucosa en sangre e insulina.

5. RESULTADO DE LA INVESTIGACIÓN 5.1. Primario. Aclarar el papel de nuestros lncRNA candidatos y sus objetivos posteriores obtenidos de muestras de tejido y/o biopsia líquida de pacientes con cáncer de mama.

5.2. Publicación(es)/Resultado de visibilidad. Artículo de revisión + una publicación internacional de Scopus Q1 que aborda los resultados encontrados + presentación de los hallazgos en una conferencia internacional de alta reputación.

6. IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIÓN 6.1. Hasta donde sabemos, este es el primer trabajo de investigación que mide el nivel de expresión de UPK1A-AS1 y/o UNC5B-AS1 en muestras clínicas de cáncer de mama.

6.2. Estos datos podrían proporcionar un enfoque prometedor para la introducción de nuevos marcadores que ayuden en el diagnóstico y pronóstico del cáncer de mama y proporcionen objetivos potenciales para la terapia génica.

7. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN 7.1. Análisis Bioinformático 7.1.1. Investigación de la expresión de nuestros lncRNA candidatos en muestras de cáncer de mama a partir del análisis interactivo de perfiles de expresión génica (GEPIA) basado en datos de The Cancer Genome Atlas (TCGA).

7.1.2. Investigación de miARN objetivo mediante herramientas bioinformáticas y/o estudios experimentales utilizando el software en línea miRcode (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. Investigación de genes diana de miARN seleccionados a través de herramientas en línea de miARN: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase o ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ y escaneo de objetivos: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Análisis de ruta o ontología genética para obtener una lista de genes diana a través de una base de datos enriquecida, la lista de genes diana se analizó para determinar su relación con las proteínas modificadoras y/o remodeladoras de la cromatina.

8. DECLARACIÓN ÉTICA 8.1.1. Esta investigación se realizará de acuerdo con las pautas establecidas por la Declaración de Helsinki que hace referencia a las pautas éticas de la Asociación Médica Mundial (WMA) para investigaciones médicas con seres humanos, publicadas originalmente en 1964, revisadas en 2013 y octubre de 2018. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Las muestras se recolectarán después del anuncio del participante y la firma del consentimiento informado.

8.1.2. Aprobación ética y consentimiento para participar. Este estudio fue aprobado por primera vez por el Comité de Ética en Investigación (REC) de la Facultad de Farmacia de la Universidad Ain Shams 9. TAMAÑO DE LA MUESTRA Y EL PODER DEL ESTUDIO 9.1. El tamaño de muestra estimado se calculó mediante la calculadora en línea de tamaño de muestra de potencia G* http://www.gpower.hhu.de/en.html. utilizando los siguientes datos de entrada: la probabilidad de error α es (0,05), la potencia de estudio (0,8). Basado en los estudios previos realizados por Bian et al, 2021; Huang et al,2021; Tan et al, 2020; Madhvan et al, 2014 [31] [12] [24] [25] que mostraron un tamaño del efecto de moderado a alto, se eligió un tamaño del efecto moderado (0,5) para calcular el tamaño de la muestra.

El tamaño total de la muestra será de 102 casos, este número se subdividirá en 2 grupos ya sea en una proporción de 50:50 o en una proporción de 60:40.

9.2. Diseño de estudio. Estudio monocéntrico, retrospectivo y de casos controlados. 9.3. Participantes del estudio. Se reclutará una serie de pacientes egipcias con cáncer de mama de la Unidad de Cáncer de Mama del Departamento de Oncología Clínica de la Universidad Ain Shams, El Cairo, Egipto.

Grupo 1; pacientes con cáncer de mama maligno no metastásico; Pacientes con cáncer de mama recién diagnosticado.

Grupo 2; grupo de control; voluntarios sanos. 9.3.1Clínico-patológico Criterios. Datos clínicos obtenidos de las historias clínicas y de los informes patológicos originales. Estos datos se compilarán en un archivo Excel detallado.

Los siguientes datos clínicos se registrarán y evaluarán como en el archivo Excel adjunto.

• Se registrarán los antecedentes familiares completos de todos los participantes con cáncer de mama.
• Historial de cáncer individual y evaluación clínica del tumor realizada utilizando la clasificación (TNM) del American Joint Committee on Cancer (AJCC).
• Se utilizará la escala Bloom-Richardson para la clasificación histológica.
• Las características de las pacientes con cáncer de mama con respecto al índice de masa corporal (IMC), hemograma completo, estado menopáusico, tipos histopatológicos de cáncer de mama; Carcinoma ductal invasivo (CDI) y Carcinoma lobulillar invasivo (CLI). Clasificaciones moleculares del cáncer de mama luminal A, B, cáncer de mama triple negativo.
• El tamaño del tumor, así como los biomarcadores clínico-patológicos CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 o PCNA (si los hay), se recopilarán de los archivos de los pacientes para realizar correlaciones y análisis estadísticos adicionales.

9.3.2. Criterios de inclusión; Pacientes egipcias con cáncer de mama de 18 años o más, recién diagnosticadas con cáncer de mama.

9.3.3 Criterios de exclusión; enfermedades de la sangre, cualquier cáncer que no sea cáncer de mama, cirrosis hepática y enfermedades de la vejiga uterina y urinaria o pacientes con cáncer de mama con cualquier evidencia de metástasis a distancia.

9.4. Muestreo de sangre: se recolectarán 6 ml de sangre periférica en vacutainers de gel polimérico con activador de coágulos (Greiner Bio-One GmbH, Australia), se dejarán durante 15 minutos. a temperatura ambiente para que coagule, seguido de 10 min. Centrifugación a 10.000 g a 4 ° C, los sueros obtenidos se dividirán en alícuotas en 5 tubos Eppendorf limpios y se almacenarán a -80 ° C, hasta la evaluación bioquímica en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Ain-Shams.

9.4.1 Los sueros almacenados se utilizarán para las mediciones de la técnica ELISA de los niveles de proteína objetivo, utilizando kits ELISA disponibles comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

9.4.2. Se extraerá el ARN genómico; Extracción de ncRNA de muestras de suero y evaluación de purificación. Cuantificación del nivel de expresión de ncRNAs, utilizando qRT-PCR en el paso uno más. Procederemos con la extracción de ARN total de la muestra de suero utilizando el mini kit miRNeasy. La síntesis de ADNc se realizará posteriormente utilizando el kit de síntesis de ADNc VERSO (Thermo Scientific, EE. UU.).

A continuación, realizaremos análisis cuantitativos de PCR en tiempo real (qRT-PCR) utilizando la mezcla maestra de PCR sybr green (Thermo Scientific, EE. UU.) y cebadores específicos diseñados para los ncRNA objetivo, así como para el gen de referencia interno.

10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 10.1. Los datos serán recolectados, tabulados en Excel, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) versión 20, será el programa utilizado o Stat4 o Graphpad Prism para figuras, 10.3. Se probará la normalidad de los datos mediante la calculadora Shapiro-Wilk, 10.3.1. Las variables normalmente distribuidas se expresarán como media + (SEM) y se analizarán utilizando dos muestras independientes. La prueba t de estudiantes y ANOVA se utilizarán para comparar 2 o más grupos, si se distribuyen normalmente, respectivamente.

10.3.2. Ajuste y normalización de factores de confusión como edad e IMC,... entre control y pacientes, así como análisis de regresión múltiple o ANCOVA para predecir un factor de confusión, 10.3.3. Los datos se presentarán como mediana (rango), si no están distribuidos normalmente, Mann-Whitney (U) o Kruskal-Wallis (H) se realizarán para comparar entre dos o más grupos independientes, respectivamente, 10.4. Los valores de P fueron de dos colas y se consideraron significativos si P <0,05,11.