„Untersuchung der Rolle wichtiger epigenetischer Mediatoren bei Brustkrebspatientinnen“

Brustkrebs gilt als eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen bei Frauen weltweit und als eine der häufigsten Todesursachen bei Frauen weltweit. Trotz bemerkenswerter Fortschritte in Diagnose und Therapie bleibt die Prognose von Brustkrebspatientinnen enttäuschend[1][2]. Brustkrebs ist eine äußerst heterogene Erkrankung, die auf der Grundlage der Expression bestimmter Hormonrezeptoren wie Östrogenrezeptor ER, Progesteronrezeptor PR und humaner epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor HER2 in vier Subtypen eingeteilt wird[2]. Im Folgenden sind die vier Subtypen von Brustkrebs aufgeführt: Luminal-A-Tumoren zeichnen sich durch das Vorhandensein von ER und/oder PR und das Fehlen von HER2 aus, Luminal-B-Tumoren sind im Vergleich zu Luminal-A-Tumoren höhergradig und haben eine schlechtere Prognose, sie sind ER-positiv und kann PR-negativ sein und eine hohe Ki67-Expression (mehr als 20 %) aufweisen, die HER2-positive Gruppe macht 10–15 % der Brustkrebserkrankungen aus und ist durch eine hohe HER2-Expression ohne ER und gekennzeichnet PR und dreifach negativer Brustkrebs, dem die Expression der vorherigen drei Rezeptoren fehlt[3][4].

Die epigenetische Regulierung der Genexpression ist die Veränderung der Genexpressionsfunktion ohne Änderung der Nukleotidsequenz. Sowohl die Aktivierung als auch die Inaktivierung krebsassoziierter Gene kann durch epigenetische Mechanismen erfolgen. Die Hauptakteure bei epigenetischen Mechanismen der Genregulation sind DNA-Methylierung, Histonmodifikation, Chromatin-Remodeler und nichtkodierende RNA-Expression[5].

Histonmodifikationen sind einer der wichtigen Regulatoren der Chromatinstruktur, die für die Genexpression von entscheidender Bedeutung ist, da sie die Zugänglichkeit der DNA für Transkriptionsregulatoren definieren, die Genexpression beeinflussen und lebenswichtige zelluläre Prozesse beeinflussen [6].

Histonmodifikationen können Transkriptionsfaktoren, Chromatin-Remodeler und Chromatin-Strukturproteine ​​rekrutieren und so zur Bildung und Aufrechterhaltung eines aktiven oder repressiven Chromatinzustands beitragen[6]. Die wichtigsten Histonmodifikationen sind: Lysinacetylierung, Lysin- und Argininmethylierung, Serin/Threonin/Tyrosin-Phosphorylierung und Serin/Threonin-Ubiquitylierung [6]. Viele Histonmodifikationsenzyme sind bei verschiedenen Krebsarten häufig mutiert, zum Beispiel: EHMT2 (G9A) kodiert für eine Methyltransferase, die Lysinreste von Histon H3 methyliert. Die Methylierung von H3 an Lysin 9 durch dieses Protein führt zur Rekrutierung zusätzlicher epigenetischer Regulatoren und zur Unterdrückung von Transkription. Die Bedeutung der Histon-Methyltransferase G9a für das neoplastische Wachstum ist gut dokumentiert[7]. Ein weiteres Beispiel für Histonmodifikationsenzyme ist KMT5B (SUV420H1), ein Methyltransferase-Enzym, das die Ablagerung der H4k20me-Markierung, einer repressiven Markierung, katalysiert und vermutlich bei vielen Krebsarten eine tumorsuppressive Rolle spielt[8].

Die Chromatinstruktur kann auch durch Chromatin-Remodeler-Komplexe reguliert werden. Dabei handelt es sich um vier konservierte Familien ATP-abhängiger Chromatin-Remodeler bei Säugetieren (CHD), (ISWI), (INO80) und (SWI/SNF), die an den meisten beteiligt sind wesentliche Zellprozesse [9].

Die Chromatin-Modifikationsmaschinerie ist bei Krebsarten, einschließlich Brustkrebs, stark fehlreguliert: Mutationen oder Inaktivierung von Genen, die Untereinheiten des SWI/SNF-Komplexes kodieren, werden bei etwa 20 % der Krebsarten gefunden[10].

Ein weiterer wichtiger epigenetischer Mechanismus ist die Wirkung nichtkodierender RNAs auf die Genexpression.

Nichtkodierende RNAs (ncRNAs) sind eine heterogene Gruppe von Transkripten, die nicht in Proteine ​​übersetzt werden. Sie haben sich als wichtige Regulatoren mehrerer biologischer Funktionen herausgestellt, und ihre Fehlregulation wird mit Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht. Aufgrund ihrer Verwendung als Biomarker für Krankheiten haben sie in der wissenschaftlichen Gemeinschaft großes Interesse geweckt. Es gibt viele Arten von ncRNAs, einschließlich miRNAs und lncRNAs[11].

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, hochkonservierte nichtkodierende RNA-Moleküle (18–25 Nukleotide), die an der Regulierung der Genexpression beteiligt sind. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass microRNAs (miRNAs) neuartige Regulatoren sind, die als Tumorsuppressoren oder Onkogene bei der Tumorprogression fungieren[12]. Es wurde berichtet, dass exosomales miR-138-5p über die Hemmung des KDM6B-Proteins eine onkogene Funktion bei Brustkrebspatientinnen ausübt[13]. Peng Bian MD et al. berichteten, dass die Expression von miR-4306 in Brustkrebsgeweben im Vergleich zu angrenzenden Geweben herunterreguliert sei[14].

Lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) sind eine andere Art nichtkodierender RNAs, die mehr als 200 Nukleotide lang sind und von denen die meisten nicht in Proteine ​​übersetzt werden[15]. Obwohl die meisten lncRNAs nicht translatiert sind, haben sie aufgrund ihrer regulatorischen Funktionen bei der Genexpression anderer Zielgene großes Forschungsinteresse geweckt[15]. LncRNAs regulieren die Genexpression auf epigenetischer, transkriptioneller, posttranskriptioneller, translationaler und posttranslationaler Ebene durch Interaktion mit mRNA, DNA, Protein und miRNA[16]. Darüber hinaus spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung biologischer Prozesse wie Histonmodifikation, Chromatin-Remodellierung, Transkriptionsinterferenz, Transkriptionsaktivierung, mRNA-Translation und RNA-Verarbeitung[16]. Kürzlich wurde festgestellt, dass lncRNAs an vielen Krebsarten wie Lungenkrebs, Leberkrebs, Prostatakrebs, Blasenkrebs und Brustkrebs beteiligt sind[2] und daher als neuartiger Biomarker und pharmazeutisches Ziel in der Krebstherapie eingesetzt werden können [17]. Beispielsweise fördert die onkogene lncRNA PVT1 die Proliferation von Brustkrebszellen über die miR-181a-2-3p/ESR1-Achse [18]. Wichtig ist, dass lncRNAs mit Chromatin-modifizierenden und remodellierenden Komplexen interagieren können, um viele normale Zellwege sowie karzinogene Wege streng zu regulieren. Sie können die Chromatin-Modifikationsmaschinerie regulieren, sei es durch direkte Interaktion oder indirekt durch Schwämmen bestimmter miRNAs. Beispiel zur direkten Interaktion bei Krebs: LncRNA UCA1 reguliert den Chromatin-Remodelling durch Bindung an SMARCA4, um dessen Bindung an seine Region auf dem p21-Promotor zu beeinträchtigen, was zur Proliferation von Blasenkrebs führt[19]. Beispiel für indirekte Interaktion bei Krebs: LncRNA-MIAT fördert das Fortschreiten von Schilddrüsenkrebs und fungiert als ceRNA, um auf EZH2 abzuzielen, indem es miR-150-5p abschwächt[20].

LncRNAs können im Plasma/Serum nachgewiesen werden und fungieren daher als nicht-invasiver Biomarker[21].

LncRNA UPK1A-AS1 ist ein neu identifizierter Biomarker bei Krebs. Es wurde berichtet, dass es eine onkogene Rolle bei Bauchspeicheldrüsenkrebs spielt, indem es durch die Reparatur von Doppelstrangbrüchen Platinresistenz verleiht[22]. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass UPK1A-AS1 die Proliferation von HCC durch Interaktion mit EZH2 förderte[23]. Obwohl berichtet wurde, dass lncRNA UPK1A-AS1 in HCC-, Bauchspeicheldrüsenkrebs- und Lungenkrebs-Zelllinien onkogen ist, wurde angenommen, dass es über das Sponging von miR-1248 eine tumorsuppressive Rolle bei Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus spielt[24][ 25].

LncRNA UNC5B-AS1 wurde als Onkogen bei Schilddrüsenkrebs, Prostatakrebs und HCC erkannt[26] [27]. Es wurde auch festgestellt, dass es eine onkogene Rolle bei Eierstockkrebs spielt, indem es die Histonmodifikation reguliert[28].

Allerdings ist die Rolle der lncRNAs UPK1A-AS1 und UNC5B-AS1 bei der Pathogenese von Brustkrebspatientinnen noch nicht geklärt.

1.2. Problemdefinition. In Ägypten ist Brustkrebs die häufigste bösartige Erkrankung bei Frauen, wobei die meisten Fälle erst in einem späten Stadium diagnostiziert werden und eine schlechte Prognose haben[29]. Im Jahr 2050 werden etwa 46.000 Vorfälle prognostiziert. Obwohl die Inzidenzrate in Ägypten niedriger ist als die weltweiten Zahlen, ist die Sterblichkeitsrate im Vergleich zu den Industrieländern um etwa das Zweifache höher (41 % gegenüber 23 %) [30]. Daher bleibt die Bereitstellung neuer Marker für die Diagnose und/oder Prognose von Brustkrebs sowie das Verständnis der molekularen Mechanismen, die ihrem Zusammenhang mit der Karzinogenese zugrunde liegen, eine Herausforderung bei der Behandlung und Behandlung von Brustkrebs.

1.3. Hypothese. Die Problemstellung besteht darin, neuartige Marker bereitzustellen, die bisher bei Brustkrebspatientinnen noch nicht untersucht wurden, um bei der Diagnose und Prognose dieser aggressiven Erkrankung zu helfen. Dementsprechend werden wir in der vorliegenden Studie die Rolle der langen nichtkodierenden RNAs UPK1A-AS1 und/oder UNC5B-AS1 als mögliche diagnostische und/oder prognostische Marker bei Brustkrebs untersuchen. Darüber hinaus wird die mögliche Wechselwirkung und Korrelation zwischen diesen langen, nicht kodierenden RNAs und Chromatin-Modifikationsenzymen und/oder Remodelling-Komplexen wie KMT5B und G9A durch Schwämmen bestimmter Ziel-miRNAs wie mir-138-5p und mir-4306 untersucht. 2. ERGEBNISSE FRÜHERER STUDIEN 2.1. Zhang et al. berichteten, dass: UPK1A-AS1 die HCC-Entwicklung fördert, indem es das Fortschreiten des Zellzyklus durch Interaktion mit EZH2 und Schwämmen von miR-138-5p beschleunigt[23].

2.2. Wang et al. berichteten, dass: UNC5B-AS1 das Fortschreiten des Eierstockkrebses förderte, indem es H3K27me auf NDRG2 über EZH2 regulierte[28].

2.3. Hauang et al. berichteten, dass: UNC5B-AS1 die Proliferation, Migration und EMT von hepatozellulären Karzinomzellen durch die Regulierung der miR-4306/KDM2A-Achse fördert[26].

3. ZIEL DER ARBEIT: Abschätzung der Expressionsniveaus unserer lncRNA-Kandidaten UPK1A-AS1 und/oder UNC5B-AS1 und Korrelation mit verschiedenen klinischen Parametern bei Brustkrebspatientinnen sowie Aufklärung ihrer möglichen Wechselwirkung mit Chromatin-modifizierenden und/oder remodellierenden Proteinen als KMT5B und G9A bei Brustkrebspatientinnen durch Schwämmen bestimmter Ziel-miRNAs wie mir-138-5p und mir-4306.

4. Forschungsziel(e) 4.1. Messen Sie die Expression von lncRNA UPK1A-AS1 und/oder UNC5B-AS1 und ihrer Ziel-miRNAs-Gene in Serumproben (Flüssigkeitsbiopsie) und/oder Gewebeproben von Brustkrebspatientinnen mithilfe der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionstechnik (qRT-PCR).

4.2. Messen Sie den Serum- und/oder Gewebezielproteinspiegel mittels ELISA. 4.3. Vergleichen Sie das Expressionsniveau dieser ncRNAs mit den klassischen Proteintumormarkern, 4.4. Korrelieren Sie diese ncRNAs und die Zielproteinspiegelachse mit den klinisch-pathologischen Merkmalen von Brustkrebs wie Tumorstadium und -grad, Tumorprogression (TNM) und anderen klassischen klinisch-pathologischen prognostischen Biomarkern wie dem karzinoembryonalen Antigen (CEA) und dem Krebsantigen 15-3 (CA15-3). ), (ER), (PR), humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2/neu), der Proliferationsmarker Ki-67 oder PCNA und vollständiges Blut Anzahl (CBC), BMI, Blutdruck, Blutzuckerspiegel und Insulin.

5. FORSCHUNGSERGEBNISSE 5.1. Primär. Erläutern Sie die Rolle unserer lncRNA-Kandidaten und ihrer nachgeschalteten Ziele, die aus Flüssigbiopsien und/oder Gewebeproben von Brustkrebspatientinnen gewonnen wurden.

5.2. Ergebnis der Veröffentlichung(en)/Sichtbarkeit. Übersichtsartikel + eine internationale Scopus Q1-Publikation, die sich mit den gefundenen Ergebnissen befasst + Präsentation der Ergebnisse auf einer internationalen hochkarätigen Konferenz.

6. FORSCHUNGSBEDEUTUNG 6.1. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Forschungsarbeit, die das Expressionsniveau von UPK1A-AS1 und/oder UNC5B-AS1 in klinischen Brustkrebsproben misst.

6.2. Diese Daten könnten einen vielversprechenden Ansatz für die Einführung neuartiger Marker darstellen, die bei der Diagnose und Prognose von Brustkrebs helfen und potenzielle Ziele für die Gentherapie darstellen.

7. FORSCHUNGSMETHODE 7.1. Bioinformatische Analyse 7.1.1. Untersuchung der Expression unserer lncRNA-Kandidaten in Brustkrebsproben anhand der interaktiven Genexpressionsprofilanalyse (GEPIA) basierend auf Daten aus den Daten des Krebsgenomatlas (TCGA).

7.1.2. Untersuchung von Ziel-miRNAs mit Bioinformatik-Tools und/oder experimentellen Studien unter Verwendung der Online-Software miRcode (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. Untersuchung ausgewählter miRNAs-Zielgene über miRNA-Online-Tools: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase oder ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ und Zielscan: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Pathway-Analyse oder Genontologie für die Liste der Zielgene über die Enrichr-Datenbank. Die Liste der Zielgene wurde auf ihre Beziehung zu Chromatin-modifizierenden und/oder remodellierenden Proteinen analysiert.

8. ETHISCHE ERKLÄRUNG 8.1.1. Diese Forschung wird in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki festgelegt wurden und sich auf die Ethikrichtlinien der Weltärztekammer (WMA) für medizinische Forschung mit menschlichen Probanden beziehen, die ursprünglich 1964 veröffentlicht, 2013 und Oktober 2018 überarbeitet wurden. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Die Proben werden nach Ankündigung und Unterzeichnung der Einverständniserklärung des Teilnehmers entnommen.

8.1.2. Ethische Zustimmung und Zustimmung zur Teilnahme. Diese Studie wurde zuerst vom Research Ethical Committee (REC) der Fakultät für Pharmazie der Ain Shams University genehmigt. 9. PROBENGRÖSSE UND DIE LEISTUNG DER STUDIE 9.1. Die geschätzte Stichprobengröße wurde mit dem Online-Rechner für die Stichprobengröße von G Power* http://www.gpower.hhu.de/en.html berechnet. Unter Verwendung der folgenden Eingabedaten beträgt die Fehlerwahrscheinlichkeit α (0,05) und die Studienstärke (0,8). Basierend auf früheren Studien von Bian et al., 2021; Huang et al., 2021; Tan et al., 2020; Madhvan et al., 2014 [31] [12] [24] [25], die eine mittlere bis hohe Effektgröße zeigten, wurde eine mittlere Effektgröße (0,5) zur Berechnung der Stichprobengröße gewählt.

Die Gesamtstichprobengröße beträgt 102 Fälle. Diese Zahl wird entweder im Verhältnis 50:50 oder im Verhältnis 60:40 in zwei Gruppen unterteilt.

9.2. Studiendesign. Fallkontrollierte, retrospektive, monozentrische Studie. 9.3. Studienteilnehmer. Eine Reihe ägyptischer weiblicher Brustkrebspatientinnen wird aus der Brustkrebsabteilung der Abteilung für klinische Onkologie der Ain Shams-Universität in Kairo, Ägypten, rekrutiert.

Gruppe 1; Patientinnen mit bösartigem, nicht metastasiertem Brustkrebs; neu diagnostizierte Brustkrebspatientinnen.

Gruppe 2; Kontrollgruppe; gesunde Freiwillige. 9.3.1Klinisch-pathologisch Kriterien. Klinische Daten aus Krankenakten und den ursprünglichen Pathologieberichten. Diese Daten werden in einer detaillierten Excel-Datei zusammengestellt.

Die folgenden klinischen Daten sind gemäß der beigefügten Excel-Datei zu erfassen und auszuwerten.

• Für alle Brustkrebsteilnehmerinnen wird die vollständige Familienanamnese erfasst.
• Individuelle Krebsanamnese und klinische Beurteilung des Tumors anhand der (TNM)-Klassifikation des American Joint Committee on Cancer (AJCC).
• Für die histologische Einstufung wird die Bloom-Richardson-Skala verwendet.
• Die Merkmale der Brustkrebspatientinnen im Hinblick auf Body-Mass-Index (BMI), CBC, Menopausenstatus, histopathologische Brustkrebstypen; invasives duktales Karzinom (IDC) und invasives lobuläres Karzinom (ILC). Molekulare Brustkrebsklassifikationen: Luminal A, B, dreifach negativer Brustkrebs.
• Zur weiteren Korrelation und statistischen Analyse werden Daten zur Tumorgröße sowie zu den klinisch-pathologischen Biomarkern CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 oder PCNA (falls vorhanden) aus Patientenakten gesammelt.

9.3.2. Einschlusskriterien; Ägyptische weibliche Brustkrebspatientinnen im Alter von 18 Jahren und älter, bei denen neu Brustkrebs diagnostiziert wurde.

9.3.3 Ausschlusskriterien; Blutkrankheiten, alle anderen Krebsarten als Brustkrebs, Leberzirrhose und Gebärmutter- und Harnblasenerkrankungen oder Brustkrebspatientinnen mit Anzeichen von Fernmetastasen.

9.4. Blutentnahme: 6 ml peripheres Blut werden in Polymergel-Vakutainern mit Gerinnungsaktivator (Greiner Bio-One GmbH, Australien) gesammelt und 15 Minuten stehen gelassen. bei Raumtemperatur zur Gerinnung, gefolgt von 10 Min. Nach Zentrifugation bei 10.000 g und 4 °C werden die erhaltenen Seren in 5 saubere Eppendorf-Röhrchen aliquotiert und bis zur biochemischen Bewertung in der Abteilung für Biochemie der Fakultät für Pharmazie der Ain-Shams-Universität bei -80 °C gelagert.

9.4.1 Gelagerte Seren werden für ELISA-Messungen der Zielproteinspiegel unter Verwendung kommerziell erhältlicher ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.

9.4.2. Genomische RNA wird extrahiert; ncRNAs-Extraktion aus Serumproben und Reinigungsbewertung. Quantifizierung des ncRNA-Expressionsniveaus unter Verwendung von qRT-PCR in Schritt eins plus. Wir werden mit der vollständigen RNA-Extraktion aus der Serumprobe mit dem miRNeasy Mini Kit fortfahren. Die c-DNA-Synthese wird anschließend mit dem VERSO c-DNA-Synthese-Kit (Thermo Scientific, USA) durchgeführt.

Als nächstes werden wir quantitative Echtzeit-PCR-Analysen (qRT-PCR) mit dem Sybr Green PCR-Mastermix (Thermo Scientific, USA) und spezifischen Primern durchführen, die für die Ziel-ncRNAs sowie das Housekeeping-Referenzgen entwickelt wurden.

10. STATISTISCHE ANALYSE 10.1. Es werden Daten gesammelt, in Excel-Tabellen aufgeführt, 10.2. Als verwendetes Programm wird SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) Version 20 oder Stat4 oder Graphpad Prism für Zahlen verwendet, 10.3. Die Daten werden mit dem Shapiro-Wilk-Rechner 10.3.1 auf Normalität getestet. Normalverteilte Variablen sind als Mittelwert+(S.E.M) auszudrücken und unter Verwendung von zwei unabhängigen Schülerstichproben zu analysieren. Der t-Test und die ANOVA sind für den Vergleich von zwei oder mehr Gruppen zu verwenden, sofern sie normalverteilt sind.

10.3.2. Anpassung und Normalisierung für Störfaktoren wie Alter und BMI, ... zwischen Kontrolle und Patienten sowie multiple Regressionsanalyse oder ANCOVA zur Vorhersage eines Störfaktors, 10.3.3. Daten, die als Median (Bereich) dargestellt werden sollen, wenn sie nicht normalverteilt sind, werden Mann-Whitney (U) oder Kruskal-Wallis (H) durchgeführt, um jeweils zwei oder mehr unabhängige Gruppen zu vergleichen, 10.4. Die P-Werte waren zweiseitig und wurden als signifikant angesehen, wenn P <0,05,11.