"Het bestuderen van de rol van belangrijke epigenetische bemiddelaars bij borstkankerpatiënten"

Borstkanker wordt beschouwd als een van de meest voorkomende kwaadaardige ziekten bij vrouwen wereldwijd en een van de belangrijkste doodsoorzaken onder vrouwen wereldwijd. Zelfs met opmerkelijke vooruitgang op het gebied van diagnose en therapie blijft de prognose van borstkankerpatiënten teleurstellend[1][2]. Borstkanker is een zeer heterogene ziekte die wordt geclassificeerd in vier subtypen, gebaseerd op de expressie van bepaalde hormonale receptoren, zoals oestrogeenreceptor ER, progesteronreceptor PR en menselijke epidermale groeifactorreceptor HER2[2]. Hieronder volgen de vier subtypes van borstkanker: Luminal A-tumoren worden gekenmerkt door de aanwezigheid van ER en/of PR en de afwezigheid van HER2, Luminal B-tumoren hebben een hogere graad en slechtere prognose vergeleken met Luminal A, ze zijn ER-positief en kan PR-negatief zijn en een hoge expressie van Ki67 hebben (meer dan 20%), de HER2-positieve groep vormt 10-15% van de borstkankers en wordt gekenmerkt door hoge HER2-waarden expressie met afwezigheid van ER en PR en triple-negatieve borstkanker waarbij de expressie van de voorgaande drie receptoren ontbreekt[3][4].

Epigenetische regulatie van genexpressie is de verandering in de genexpressiefunctie zonder de nucleotidesequentie te veranderen. Zowel activatie als inactivatie van met kanker geassocieerde genen kunnen plaatsvinden door epigenetische mechanismen. De belangrijkste spelers in epigenetische mechanismen van genregulatie zijn DNA-methylatie, histonmodificatie, chromatine-remodelers en niet-coderende RNA-expressie [5].

Histone-modificaties zijn een van de belangrijke regulatoren van de chromatinestructuur, wat zeer cruciaal is voor genexpressie, omdat het de toegankelijkheid van DNA voor transcriptionele regulatoren definieert, de genexpressie beïnvloedt en vitale cellulaire processen beïnvloedt [6].

Histone-modificaties kunnen transcriptiefactoren, chromatine-remodelers en structurele chromatine-eiwitten rekruteren en zo bijdragen aan de vorming en instandhouding van een actieve of repressieve chromatinetoestand [6]. De belangrijkste histonmodificaties zijn: lysineacetylering, lysine- en argininemethylering, serine/threonine/tyrosinefosforylering en serine/threonine-ubiquitylering [6]. Veel van de histonmodificatie-enzymen worden vaak gemuteerd bij verschillende soorten kanker, bijvoorbeeld: EHMT2 (G9A) codeert voor een methyltransferase die lysineresiduen van histon H3 methyleert. Methylering van H3 op lysine 9 door dit eiwit resulteert in de rekrutering van extra epigenetische regulatoren en onderdrukking van transcriptie. Het histonmethyltransferase G9a is goed gedocumenteerd vanwege zijn implicatie bij neoplastische groei [7]. Een ander voorbeeld van histon-modificatie-enzymen is KMT5B (SUV420H1), een methyltransferase-enzym dat de afzetting van het H4k20me-merkteken, een repressief merkteken, katalyseert en waarvan wordt aangenomen dat het een tumoronderdrukkende rol speelt bij veel soorten kanker [8].

De chromatinestructuur kan ook worden gereguleerd door complexen van chromatine-remodelers. Het zijn vier geconserveerde families van ATP-afhankelijke chromatine-remodelers bij zoogdieren (CHD), (ISWI), (INO80) en (SWI/SNF), en zijn betrokken bij de meeste essentiële celprocessen [9].

De machines voor chromatinemodificatie zijn sterk ontregeld bij kankers, waaronder bijvoorbeeld borstkanker: mutaties of inactivatie van genen die coderen voor subeenheden van het SWI/SNF-complex worden bij ongeveer 20% van de kankers aangetroffen[10].

Een ander belangrijk epigenetisch mechanisme is het effect van niet-coderende RNA's op genexpressie.

Niet-coderende RNA's (ncRNA's) zijn een heterogene groep transcripten die niet in eiwitten worden vertaald. Ze zijn naar voren gekomen als belangrijke regulatoren van meerdere biologische functies, en hun ontregeling is betrokken bij ziekten, waaronder kanker. Ze hebben grote belangstelling gekregen van de wetenschappelijke gemeenschap vanwege hun gebruik als biomarkers voor ziekten. Er zijn veel soorten ncRNA's, waaronder miRNA's en lncRNA's[11].

MicroRNA's (miRNA's) zijn kleine, sterk geconserveerde niet-coderende RNA-moleculen (18-25) nucleotiden die betrokken zijn bij de regulatie van genexpressie. Uit steeds meer onderzoeken is gebleken dat microRNA's (miRNA's) nieuwe regulatoren zijn die fungeren als tumoronderdrukkers of oncogenen bij tumorprogressie[12]. Er werd gerapporteerd dat exosomaal miR-138-5p een oncogene functie uitoefent bij borstkankerpatiënten via het remmen van het KDM6B-eiwit [13]. Peng Bian MD et al. rapporteerden dat de expressie van miR-4306 naar verluidt gedownreguleerd is in borstkankerweefsels in vergelijking met aangrenzende weefsels [14].

Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) zijn een ander type niet-coderende RNA's die meer dan 200 nucleotiden lang zijn en de meeste ervan worden niet in eiwitten vertaald [15]. Ondanks het feit dat de meeste lncRNA's niet worden vertaald, hebben ze enorme belangstelling gekregen voor onderzoek vanwege hun regulerende functies op de genexpressie van andere doelgenen [15]. LncRNA's reguleren genexpressie op epigenetische, transcriptionele, post-transcriptionele, translationele en post-translationele niveaus door interactie met mRNA, DNA, eiwit en miRNA [16]. Bovendien spelen ze een cruciale rol bij het in stand houden van biologische processen zoals histonmodificatie, hermodellering van chromatine, transcriptionele interferentie, transcriptionele activering, mRNA-translatie en RNA-verwerking [16]. Onlangs werd gesteld dat lncRNA's betrokken zijn bij veel vormen van kanker, zoals longkanker, leverkanker, prostaatkanker, blaaskanker en borstkanker [2] en dus kunnen worden gebruikt als een nieuwe biomarker en farmaceutisch doelwit bij kankertherapie [17]. Het oncogene lncRNA PVT1 bevordert bijvoorbeeld de proliferatie van borstkankercellen via de miR-181a-2-3p/ESR1-as [18]. Belangrijk is dat lncRNA's een overspraak kunnen hebben met chromatinemodificerende en hermodellerende complexen om veel normale cellulaire routes en carcinogene routes strak te reguleren. Ze kunnen de chromatinemodificatiemachines reguleren, hetzij door directe interactie, hetzij indirect via het sponzen van bepaalde miRNA's. Voorbeeld van directe interactie bij kanker: LncRNA UCA1 reguleert de hermodellering van chromatine via binding met SMARCA4 om de binding ervan aan zijn regio op de p21-promoter te verminderen, wat leidt tot proliferatie van blaaskanker [19]. Voorbeeld van indirecte interactie bij kanker: LncRNA-MIAT bevordert de progressie van schildklierkanker en functioneert als ceRNA om zich op EZH2 te richten door miR-150-5p te sponzen [20].

LncRNA's kunnen worden gedetecteerd in plasma/serum en fungeren dus als niet-invasieve biomarker[21].

LncRNA UPK1A-AS1 is een nieuw geïdentificeerde biomarker bij kanker. Er werd gerapporteerd dat het een oncogene rol speelt bij pancreaskanker door het verlenen van platinaresistentie door middel van dubbelstrengsbreukherstel [22]. Bovendien werd gesteld dat UPK1A-AS1 de proliferatie van HCC bevorderde door interactie met EZH2 [23]. Ondanks het feit dat lncRNA UPK1A-AS1 oncogeen zou zijn bij HCC-, pancreaskanker- en longkankercellijnen, werd aangenomen dat het een tumoronderdrukkende rol speelt bij slokdarmkanker van plaveiselcelcarcinoomcellen via het sponsen van miR-1248. 25].

LncRNA UNC5B-AS1 is erkend als een oncogen bij schildklierkanker, prostaatkanker en HCC [26] [27]. Er werd ook gesteld dat het een oncogene rol speelt bij eierstokkanker via het reguleren van histonmodificatie [28].

De rol van lncRNA's UPK1A-AS1 en UNC5B-AS1 in de pathogenese van borstkankerpatiënten is echter nog niet onthuld.

1.2. Probleemdefinitie. In Egypte is borstkanker de meest voorkomende maligniteit bij vrouwen, waarbij de meeste gevallen in een laat stadium worden gediagnosticeerd met een slechte prognose[29]. Er worden in 2050 ongeveer 46.000 incidentgevallen voorspeld. Hoewel de incidentie in Egypte lager is dan de mondiale cijfers, is het sterftecijfer veel hoger in vergelijking met de ontwikkelde landen, ongeveer tweemaal zo hoog (41% versus 23%) [30]. Het verschaffen van nieuwe markers voor de diagnose en/of prognose van borstkanker en het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan hun verband met carcinogenese blijft dus een uitdaging bij de behandeling en behandeling van borstkanker.

1.3. Hypothese. De probleemstelling is namelijk om nieuwe markers te verschaffen die nog niet eerder bij borstkankerpatiënten zijn onderzocht, om te helpen bij de diagnose en prognose van deze agressieve ziekte. Dienovereenkomstig zullen we in de huidige studie de rol onderzoeken van lange niet-coderende RNA's UPK1A-AS1 en/of UNC5B-AS1 als mogelijke diagnostische en/of prognostische markers bij borstkanker. Bovendien zal de mogelijke overspraak en correlatie tussen deze lange niet-coderende RNA's en chromatinemodificatie-enzymen en/of remodelleringscomplexen zoals KMT5B en G9A via het sponzen van bepaalde doel-miRNA's als mir-138-5p en mir-4306 worden onderzocht. 2. BEVINDINGEN VAN EERDERE ONDERZOEKEN 2.1. Zhang et al. rapporteerde dat: UPK1A-AS1 de ontwikkeling van HCC bevordert door de voortgang van de celcyclus te versnellen door interactie met EZH2 en het sponzen van miR-138-5p [23].

2.2. Wang et al. rapporteerde dat: UNC5B-AS1 de progressie van eierstokkanker bevorderde door de H3K27me op NDRG2 via EZH2 te reguleren [28].

2.3. Hauang et al. rapporteerde dat: UNC5B-AS1 de proliferatie, migratie en EMT van hepatocellulaire carcinoomcellen bevordert via het reguleren van de miR-4306 / KDM2A-as [26].

3. DOEL VAN HET WERK Het schatten van de expressieniveaus van onze kandidaat-lncRNA's UPK1A-AS1 en/of UNC5B-AS1 en het correleren ervan met verschillende klinische parameters bij borstkankerpatiënten, en het werpen van licht op hun mogelijke overspraak met chromatinemodificerende en/of remodellerende eiwitten als KMT5B en G9A bij borstkankerpatiënten via het sponzen van bepaalde doel-miRNA's als mir-138-5p en mir-4306.

4. ONDERZOEKDOELSTELLING(EN) 4.1. Meet de genexpressie van lncRNA UPK1A-AS1 en/of UNC5B-AS1 en hun doel-miRNA's in serummonsters (vloeibare biopsie) en/of weefselmonsters van borstkankerpatiënten, met behulp van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactietechniek (qRT-PCR).

4.2. Meet het niveau van serum- en/of weefseldoeleiwitten door middel van ELISA. 4.3. Vergelijk het expressieniveau van deze ncRNA's met de klassieke eiwittumormarkers, 4.4. Correleer deze ncRNA's en de doeleiwitniveau-as met de klinisch-pathologische kenmerken van borstkanker als tumorstadium en -graad, tumorprogressie (TNM) en andere klassieke klinisch-pathologische prognostische biomarkers zoals carcino-embryonaal antigeen (CEA), kankerantigeen 15-3 (CA15-3). ), (ER), (PR), menselijke epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2/neu), de proliferatiemarker Ki-67 of PCNA en volledig bloedbeeld (CBC), BMI, BP, bloedsuikerspiegel en insuline.

5. ONDERZOEKSRESULTATEN 5.1. Primair. De rol ophelderen van onze kandidaat-lncRNA's en hun stroomafwaartse doelwitten verkregen uit vloeibare biopsie- en/of weefselmonsters van borstkankerpatiënten.

5.2. Publicatie(s)/Visibiliteitsresultaat. Reviewartikel + één internationale Scopus Q1-publicatie waarin de gevonden resultaten worden behandeld + de bevindingen worden gepresenteerd op een internationale conferentie met een hoge reputatie.

6. ONDERZOEKSBELANG 6.1. Voor zover ons bekend is dit het eerste onderzoekswerk dat het expressieniveau van UPK1A-AS1 en/of UNC5B-AS1 meet in klinische monsters van borstkanker.

6.2. Deze gegevens zouden een veelbelovende aanpak kunnen bieden bij de introductie van nieuwe markers die helpen bij de diagnose en prognose van borstkanker en potentiële doelwitten vormen voor gentherapie.

7. ONDERZOEKSMETHODOLOGIE 7.1. Bio-informatica-analyse 7.1.1. Onderzoek naar de expressie van onze kandidaat-lncRNA's in borstkankermonsters op basis van interactieve analyse van genexpressieprofilering (GEPIA) op basis van gegevens uit de gegevens van de Cancer Genome Atlas (TCGA).

7.1.2. Onderzoek naar doel-miRNA's met behulp van bio-informatica-instrumenten en/of experimentele studies met behulp van de online software miRcode (//mircode.org/index.php).

7.1.3. Onderzoek naar geselecteerde miRNA's-doelgenen via miRNA online tools: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase of ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ en doelscan: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Pathway-analyse of Gene Ontology voor een lijst van doelgenen via de enrichr-database, de lijst met doelgenen werd geanalyseerd op hun relatie met chromatine-modificerende en/of hermodellerende eiwitten.

8. ETHISCHE VERKLARING 8.1.1. Dit onderzoek zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki, verwijzend naar de ethische richtlijnen van de World Medical Association (WMA) voor medisch onderzoek met menselijke proefpersonen, oorspronkelijk gepubliceerd in 1964, herzien in 2013 en oktober 2018. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Monsters worden verzameld na aankondiging door de deelnemer en ondertekening van geïnformeerde toestemming.

8.1.2. Ethische goedkeuring en toestemming om deel te nemen. Deze studie werd voor het eerst goedgekeurd door de Research Ethical Committee (REC) van de Faculteit Farmacie, Ain Shams University. 9. STEEKPROEFOMvang EN DE KRACHT VAN STUDIE 9.1. De geschatte steekproefomvang werd berekend door de G power* online steekproefomvang-calculator http://www.gpower.hhu.de/en.html, met behulp van de volgende invoergegevens: α-foutkans is (0,05), de onderzoekskracht (0,8). Gebaseerd op de eerdere onderzoeken uitgevoerd door Bian et al, 2021;Huang et al,2021; Tan et al,2020; Madhvan et al,2014 [31] [12] [24] [25] die een gemiddelde tot hoge effectgrootte vertoonden, werd een gematigde effectgrootte (0,5) gekozen om de steekproefomvang te berekenen.

De totale steekproefomvang zal 102 gevallen bedragen, dit aantal zal worden onderverdeeld in 2 groepen, hetzij in de verhouding 50:50, hetzij in de verhouding 60:40.

9.2. Studie ontwerp. Casusgecontroleerde, retrospectieve, monocentrische studie. 9.3. Studie deelnemers. Een reeks Egyptische vrouwelijke borstkankerpatiënten zal worden gerekruteerd bij de Breast Cancer Unit, afdeling Klinische Oncologie, Ain Shams Universiteit, Caïro, Egypte.

Groep 1; kwaadaardige niet-gemetastaseerde borstkankerpatiënten; nieuw gediagnosticeerde borstkankerpatiënten.

Groep 2; controlegroep; gezonde vrijwilligers. 9.3.1 Klinisch-pathologisch Criteria. Klinische gegevens verkregen uit medische dossiers en de originele pathologierapporten. Deze gegevens worden verzameld in een gedetailleerd Excel-bestand.

De volgende klinische gegevens moeten worden vastgelegd en beoordeeld zoals in bijgevoegd Excel-bestand.

• Van alle deelnemers aan borstkanker wordt de volledige familiegeschiedenis geregistreerd.
• Individuele kankergeschiedenis en de klinische beoordeling van de tumor, uitgevoerd met behulp van de (TNM) classificatie van het American Joint Committee on Cancer (AJCC).
• Voor histologische beoordeling zal de Bloom-Richardson-schaal worden gebruikt.
• De kenmerken van borstkankerpatiënten met betrekking tot body mass index (BMI), CBC, menopauzestatus, histopathologische typen van borstkanker; invasief ductaal carcinoom (IDC) en invasief lobulair carcinoom (ILC). Moleculaire classificaties van borstkanker luminale A, B, drievoudige negatieve borstkanker.
• Gegevens over de tumorgrootte en de klinisch-pathologische biomarkers CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 of PCNA (indien aanwezig) zullen uit patiëntendossiers worden verzameld voor verdere correlaties en statistische analyse.

9.3.2. Inclusiecriteria; Egyptische borstkankerpatiënten bij vrouwen van 18 jaar en ouder, bij wie onlangs de diagnose borstkanker is gesteld.

9.3.3 Uitsluitingscriteria; bloedziekten, elke vorm van kanker anders dan borstkanker, levercirrose en baarmoeder- en urineblaasziekten of borstkankerpatiënten met enig bewijs van metastasen op afstand.

9.4. Bloedafname: 6 ml perifeer bloed wordt verzameld in polymeergelvacutainers met stolselactivator (Greiner Bio-One GmbH, Australië), gedurende 15 minuten. bij kamertemperatuur om te stollen, gevolgd door een behandeling van 10 minuten. Centrifugatie bij 10.000 g bij 4°C, de verkregen sera worden verdeeld in 5 schone Eppendorf-buisjes en bewaard bij -80°C, tot biochemische beoordeling bij de afdeling Biochemie, Faculteit Farmacie, Ain-Shams Universiteit.

9.4.1 Opgeslagen sera zullen worden gebruikt voor ELISA-techniekmetingen van doeleiwitniveaus, met behulp van in de handel verkrijgbare ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant.

9.4.2. Genomisch RNA zal worden geëxtraheerd; Extractie van ncRNA's uit serummonsters en evaluatie van de zuivering. kwantificering van het expressieniveau van ncRNA's, met behulp van qRT-PCR in stap één plus. We gaan verder met totale RNA-extractie uit het serummonster met behulp van miRNeasy Mini Kit. De c-DNA-synthese zal daarna worden uitgevoerd met behulp van de VERSO c-DNA-synthesekit (Thermo Scientific, VS).

Vervolgens zullen we kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) analyses uitvoeren met behulp van de sybr green PCR master mix (Thermo Scientific, VS) en specifieke primers ontworpen voor de doel-ncRNA's en het huishoudreferentiegen.

10. STATISTISCHE ANALYSE 10.1. Gegevens zullen worden verzameld, in Excel-tabellen worden gezet, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) versie 20, zal het gebruikte programma zijn van Stat4 of Graphpad Prism voor figuren, 10.3. Gegevens zullen worden getest op normaliteit door de Shapiro-Wilk-calculator, 10.3.1. Normaal verdeelde variabelen moeten worden uitgedrukt als gemiddelde+(S.E.M) en worden geanalyseerd met behulp van twee steekproeven. De t-test en ANOVA van onafhankelijke studenten moeten worden gebruikt voor de vergelijking van respectievelijk twee of meer groepen, indien normaal verdeeld.

10.3.2. Aanpassing en normalisatie voor confounders als leeftijd en BMI, .. tussen controle en patiënten, evenals meervoudige regressieanalyse of ANCOVA om een ​​confounder te voorspellen, 10.3.3. Gegevens die moeten worden gepresenteerd als mediaan (bereik), indien niet normaal verdeeld, Mann-Whitney (U) of Kruskal-Wallis (H), zullen worden uitgevoerd om respectievelijk twee of meer onafhankelijke groepen te vergelijken, 10.4. P-waarden waren tweezijdig en werden als significant beschouwd als P <0,05,11.