„Studium role klíčových epigenetických mediátorů u pacientek s rakovinou prsu“

Karcinom prsu je celosvětově považován za jednu z nejčastějších malignit u žen a jednu z hlavních příčin úmrtí žen na celém světě. I přes pozoruhodný pokrok v diagnostice a terapii zůstává prognóza pacientek s rakovinou prsu zklamáním[1][2]. Karcinom prsu je vysoce heterogenní onemocnění, které je klasifikováno do čtyř podtypů na základě exprese určitých hormonálních receptorů, jako je estrogenový receptor ER, progesteronový receptor PR a receptor lidského epidermálního růstového faktoru HER2[2]. Následují čtyři podtypy karcinomu prsu: Luminální A tumory jsou charakterizovány přítomností ER a/nebo PR a nepřítomností HER2, Luminal B tumory jsou vyššího stupně a horší prognózy ve srovnání s Luminal A, jsou ER pozitivní a může být PR negativní a mít vysokou expresi Ki67 (více než 20 %), HER2-pozitivní skupina tvoří 10-15 % karcinomů prsu a je charakterizována vysokou expresí HER2 s absence ER a PR a Triple-negativní karcinom prsu, který postrádá expresi předchozích tří receptorů[3][4].

Epigenetická regulace genové exprese je změna funkce genové exprese beze změny nukleotidové sekvence. Jak aktivace, tak inaktivace genů spojených s rakovinou může probíhat epigenetickými mechanismy. Hlavními hráči v epigenetických mechanismech genové regulace jsou methylace DNA, modifikace histonů, remodelátory chromatinu a exprese nekódující RNA[5].

Histonové modifikace jsou jedním z důležitých regulátorů struktury chromatinu, který je velmi důležitý pro genovou expresi, protože určuje dostupnost DNA pro regulátory transkripce, ovlivňuje genovou expresi a ovlivňuje životně důležité buněčné procesy [6].

Modifikace histonů mohou získávat transkripční faktory, remodelátory chromatinu a strukturní proteiny chromatinu, takže přispívají k tvorbě a udržování aktivního nebo represivního stavu chromatinu[6]. Nejdůležitější modifikace histonů jsou: acetylace lysinu, methylace lysinu a argininu, fosforylace serinu/threoninu/tyrosinu a ubikvitylace serinu/threoninu [6]. Mnoho enzymů modifikujících histony je často mutováno u různých typů rakoviny, například: EHMT2 (G9A) kóduje methyltransferázu, která methyluje lysinové zbytky histonu H3, Methylace H3 na lysinu 9 tímto proteinem vede k náboru dalších epigenetických regulátorů a represi transkripce. Histon methyltransferáza G9a je dobře zdokumentována pro její implikaci v neoplastickém růstu[7]. Dalším příkladem enzymů modifikujících histony je KMT5B (SUV420H1), enzym methyltransferázy, který katalyzuje ukládání značky H4k20me, represivní značky a má se za to, že má roli supresoru nádorů u mnoha typů rakoviny[8].

Struktura chromatinu může být také regulována komplexy remodelátorů chromatinu, jsou to čtyři konzervované rodiny remodelátorů chromatinu závislých na ATP u savců (CHD), (ISWI), (INO80) a (SWI/SNF) a jsou zapojeny do většiny základní buněčné procesy [9].

Mechanismus modifikace chromatinu je vysoce dysregulován u rakoviny, včetně rakoviny prsu, například: mutace nebo inaktivace genů kódujících podjednotky komplexu SWI/SNF se nacházejí přibližně u 20 % rakovin[10].

Dalším důležitým epigenetickým mechanismem je vliv nekódujících RNA na genovou expresi.

Nekódující RNA (ncRNA) jsou heterogenní skupinou transkriptů, které nejsou překládány do proteinů. Objevily se jako důležité regulátory mnoha biologických funkcí a jejich dysregulace se podílí na onemocněních včetně rakoviny. Získaly si obrovský zájem mezi vědeckou komunitou díky jejich použití jako biomarkerů onemocnění. Existuje mnoho typů ncRNA včetně miRNA a lncRNA[11].

MikroRNA (miRNA) jsou malé, vysoce konzervované nekódující molekuly RNA (18-25) nukleotidy zapojené do regulace genové exprese. Hromadné studie odhalily, že mikroRNA (miRNA) jsou nové regulátory působící jako nádorové supresory nebo onkogeny při progresi nádoru[12]. Bylo publikováno, že exosomální miR-138-5p má onkogenní funkci u pacientek s rakovinou prsu prostřednictvím inhibice proteinu KDM6B[13]. Peng Bian MD et al uvedli, že exprese miR-4306 byla ve srovnání se sousedními tkáněmi snížena ve tkáních rakoviny prsu[14].

Dlouhé nekódující RNA (lncRNA) jsou dalším typem nekódujících RNA, které jsou dlouhé více než 200 nukleotidů a většina z nich není přeložena na proteiny[15]. Navzdory skutečnosti, že většina lncRNA není translatována, získaly velký zájem o výzkum kvůli jejich regulačním funkcím na genovou expresi jiných cílových genů[15]. LncRNA regulují genovou expresi na epigenetické, transkripční, posttranskripční, translační a posttranslační úrovni interakcí s mRNA, DNA, proteinem a miRNA[16]. Kromě toho mají klíčovou roli při udržování biologických procesů, jako je modifikace histonů, remodelace chromatinu, transkripční interference, transkripční aktivace, translace mRNA a zpracování RNA[16]. Nedávno bylo uvedeno, že lncRNA se podílejí na mnoha rakovinách, jako je rakovina plic, rakovina jater, rakovina prostaty, rakovina močového měchýře a rakovina prsu[2], takže mohou být použity jako nový biomarker a farmaceutický cíl v terapii rakoviny [17]. Například onkogenní lncRNA PVT1 podporuje proliferaci buněk rakoviny prsu prostřednictvím osy miR-181a-2-3p/ESR1 [18]. Důležité je, že lncRNA mohou mít přeslech s komplexy modifikujícími a remodelujícími chromatin, aby těsně regulovaly mnoho normálních buněčných drah, stejně jako karcinogenních drah. Mohou regulovat mechanismus modifikace chromatinu, ať už přímou interakcí nebo nepřímo prostřednictvím houbování určitých miRNA. Příklad přímé interakce u rakoviny: LncRNA UCA1 reguluje remodelaci chromatinu prostřednictvím vazby se SMARCA4, aby narušila jeho vazbu k jeho oblasti na promotoru p21, což vede k proliferaci rakoviny močového měchýře[19]. Příklad nepřímé interakce u rakoviny: LncRNA-MIAT podporuje progresi rakoviny štítné žlázy a funguje jako ceRNA pro cílení na EZH2 houbováním miR-150-5p[20].

LncRNA mohou být detekovány v plazmě/séru, takže fungují jako neinvazivní biomarker[21].

LncRNA UPK1A-AS1 je nově identifikovaný biomarker u rakoviny. Bylo hlášeno, že má onkogenní roli u rakoviny pankreatu tím, že uděluje rezistenci na platinu prostřednictvím opravy dvouřetězcových zlomů [22]. Kromě toho bylo uvedeno, že UPK1A-AS1 podporuje proliferaci HCC interakcí s EZH2[23]. Navzdory skutečnosti, že lncRNA UPK1A-AS1 byla hlášena jako onkogenní v buněčných liniích HCC, rakoviny slinivky břišní a rakoviny plic, věřilo se, že má roli supresoru nádoru v rakovině buněk karcinomu dlaždicových buněk jícnu prostřednictvím houbovité miR-1248[24][24] 25].

LncRNA UNC5B-AS1 byla rozpoznána jako onkogen u rakoviny štítné žlázy, rakoviny prostaty a HCC[26] [27]. Bylo také uvedeno, že má onkogenní roli u rakoviny vaječníků prostřednictvím regulace modifikace histonů[28].

Role lncRNA UPK1A-AS1 a UNC5B-AS1 v patogenezi pacientek s rakovinou prsu však dosud nebyla odhalena.

1.2. Definice problému. V Egyptě je rakovina prsu nejčastějším zhoubným nádorem u žen, přičemž většina případů je diagnostikována v pozdní fázi se špatnou prognózou[29]. V roce 2050 se předpokládá přibližně 46 000 případů incidentů. Ačkoli je míra incidence v Egyptě nižší než celosvětová čísla, úmrtnost je mnohem vyšší ve srovnání s vyspělými zeměmi přibližně 2krát (41 % vs. 23 %) [30]. Poskytnutí nových markerů pro diagnostiku a/nebo prognózu karcinomu prsu, stejně jako pochopení molekulárních mechanismů, které jsou základem jejich spojení s karcinogenezí, tedy zůstává výzvou v managementu a léčbě karcinomu prsu.

1.3. Hypotéza. Problémem je poskytnout nové markery, které nebyly dosud u pacientek s rakovinou prsu studovány, aby pomohly při diagnostice a prognóze tohoto agresivního onemocnění. V souladu s tím budeme v této studii zkoumat roli dlouhých nekódujících RNA UPK1A-AS1 a/nebo UNC5B-AS1 jako možných diagnostických a/nebo prognostických markerů u rakoviny prsu. Kromě toho bude zkoumán možný přeslech a korelace mezi těmito dlouhými nekódujícími RNA a enzymy modifikujícími chromatin a/nebo remodelačními komplexy jako KMT5B a G9A prostřednictvím houbování určitých cílových miRNA jako mir-138-5p a mir-4306. 2. ZJIŠTĚNÍ PŘEDCHOZÍCH STUDIÍ 2.1. Zhang a kol. uvedli, že: UPK1A-AS1 podporuje vývoj HCC urychlením progrese buněčného cyklu prostřednictvím interakce s EZH2 a houbou miR-138-5p[23].

2.2. Wang a kol. uvedl, že: UNC5B-AS1 podporoval progresi rakoviny vaječníků regulací H3K27me na NDRG2 prostřednictvím EZH2[28].

2.3. Hauang a kol. uvedli, že: UNC5B-AS1 podporuje proliferaci, migraci a EMT buněk hepatocelulárního karcinomu prostřednictvím regulace osy miR-4306/KDM2A[26].

3. CÍL PRÁCE Odhadnout úrovně exprese našich kandidátních lncRNA UPK1A-AS1 a/nebo UNC5B-AS1 a uvést je do korelace s různými klinickými parametry u pacientek s rakovinou prsu a objasnit jejich možné přeslechy s proteiny modifikujícími a/nebo remodelujícími chromatin jako KMT5B a G9A u pacientek s rakovinou prsu prostřednictvím houbování určitých cílových miRNA jako mir-138-5p a mir-4306.

4. CÍL VÝZKUMU 4.1. Změřte lncRNA UPK1A-AS1 a/nebo UNC5B-AS1 a jejich cílovou genovou expresi miRNA ve vzorcích séra (tekutá biopsie) a/nebo ve vzorcích tkání od pacientů s rakovinou prsu pomocí techniky kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qRT-PCR).

4.2. Změřte hladinu sérových a/nebo tkáňových cílových proteinů pomocí ELISA. 4.3. Porovnejte tyto úrovně exprese ncRNA s klasickými proteinovými nádorovými markery, 4.4. Porovnejte tyto ncRNA a osu cílových proteinů s klinicko-patologickými charakteristikami rakoviny prsu, jako je stádium a stupeň nádoru, progrese nádoru (TNM) a další klasické klinicko-patologické prognostické biomarkery, jako je karcinoembryonální antigen (CEA), rakovinový antigen 15-3 (CA15-3 ), (ER), (PR), receptor lidského epidermálního růstového faktoru 2 (HER2/neu), proliferační marker Ki-67 nebo PCNA a kompletní krev počet (CBC), BMI, TK, hladina glukózy v krvi a inzulín.

5. VÝSLEDKY VÝZKUMU 5.1. Primární. Objasněte roli našich kandidátských lncRNA a jejich následných cílů získaných z tekuté biopsie a/nebo vzorků tkáně pacientů s rakovinou prsu.

5.2. Publikace/výsledek viditelnosti. Přehledový článek + jedna mezinárodní publikace Scopus Q1 zabývající se nalezenými výsledky + prezentující zjištění na mezinárodní konferenci s vysokou reputací.

6. VÝZNAM VÝZKUMU 6.1. Podle našich nejlepších znalostí se jedná o první výzkumnou práci měřící hladinu exprese UPK1A-AS1 a/nebo UNC5B-AS1 v klinických vzorcích rakoviny prsu.

6.2. Tato data by mohla poskytnout slibný přístup při zavádění nových markerů, které pomáhají při diagnostice a prognóze rakoviny prsu a poskytují potenciální cíle pro genovou terapii.

7. METODIKA VÝZKUMU 7.1. Bioinformatická analýza 7.1.1. Zkoumání exprese naší kandidátní lncRNA ve vzorcích rakoviny prsu z interaktivní analýzy profilování genové exprese (GEPIA) na základě dat z dat The Cancer Genome Atlas (TCGA).

7.1.2. Zkoumání cílových miRNA pomocí bioinformatických nástrojů a/nebo experimentálních studií pomocí online softwaru miRcode (http://mircode.org/index.php).

7.1.3. Zkoumání vybraných cílových genů miRNA pomocí online nástrojů miRNA: miRDB https://mirdb.org/index.html, starBase nebo ENCORI: https://rnasysu.com/encori/ a cílové skenování: https://www.targetscan.org/vert_80/.

7.1.4. Pathway analysis nebo Gene Ontology pro seznam cílových genů prostřednictvím obohacené databáze, seznam cílových genů byl analyzován na jejich vztah k proteinům modifikujícím a/nebo remodelujícím chromatin.

8. ETICKÉ PROHLÁŠENÍ 8.1.1. Tento výzkum bude prováděn v souladu s pokyny stanovenými Helsinskou deklarací odkazující na etické pokyny Světové lékařské asociace (WMA) pro lékařský výzkum na lidských subjektech, původně publikované v roce 1964, revidované v roce 2013 a říjnu 2018. (https://www.wma.net/policies-post/wma-declaration-of-helsinki-ethical-principles-for-medical-research-involving-human-subjects/).

Vzorky budou odebrány po oznámení účastníka a podepsání informovaného souhlasu.

8.1.2. Etický souhlas a souhlas s účastí. Tato studie byla poprvé schválena Etickou komisí pro výzkum (REC) Farmaceutické fakulty Univerzity Ain Shams 9. VELIKOST VZORKU A SÍLA STUDIE 9.1. Odhadovaná velikost vzorku byla vypočtena pomocí online kalkulačky velikosti vzorku G power* http://www.gpower.hhu.de/en.html, pomocí následujících vstupních dat: α pravděpodobnost chyby je (0,05), síla studie (0,8). Na základě předchozích studií provedených Bianem et al, 2021; Huang et al, 2021; Tan a kol., 2020; Madhvan et al, 2014 [31] [12] [24] [25], které vykazovaly střední až vysokou velikost účinku, pro výpočet velikosti vzorku byla vybrána střední velikost účinku (0,5).

Celková velikost vzorku bude 102 případů, tento počet bude rozdělen do 2 skupin buď poměrem 50:50 nebo poměrem 60:40.

9.2. Design studie. Případově kontrolovaná, retrospektivní, monocentrická studie. 9.3. Účastníci studie. Řada egyptských pacientek s rakovinou prsu bude přijata z oddělení rakoviny prsu, oddělení klinické onkologie, Univerzita Ain Shams, Káhira, Egypt.

Skupina 1; pacientky s maligním nemetastatickým karcinomem prsu; nově diagnostikované pacientky s rakovinou prsu.

Skupina 2; kontrolní skupina; zdravých dobrovolníků. 9.3.1Klinicko-patologické Kritéria. Klinická data získaná z lékařských záznamů a původních patologických zpráv. Tyto údaje se sestaví do podrobného souboru Excel.

Následující klinická data se zaznamenávají a vyhodnocují jako v přiloženém excelovém souboru.

• U všech účastníků rakoviny prsu bude zaznamenána úplná rodinná anamnéza.
• Individuální anamnéza rakoviny a klinické hodnocení nádoru prováděné pomocí klasifikace (TNM) Amerického společného výboru pro rakovinu (AJCC).
• Bloom-Richardsonova škála bude použita pro histologické hodnocení.
• Charakteristiky pacientek s rakovinou prsu s ohledem na index tělesné hmotnosti (BMI), CBC, menopauzální stav, histopatologické typy rakoviny prsu; invazivní duktální karcinom (IDC) a invazivní lobulární karcinom (ILC). Molekulární klasifikace karcinomu prsu luminální A, B, triple negativní karcinom prsu.
• Údaje o velikosti nádoru a také o klinicko-patologických biomarkerech CEA, CA15-3, ER, PR, Her2/neu, Ki-67 nebo PCNA (pokud existují) budou shromážděny ze souborů pacientů pro další korelace a statistickou analýzu.

9.3.2. Inkluzní kritéria; Egyptské pacientky s rakovinou prsu ve věku 18 let a více, u kterých byla nově diagnostikována rakovina prsu.

9.3.3 Kritéria vyloučení; onemocnění krve, jakákoli rakovina jiná než rakovina prsu, cirhóza jater a onemocnění dělohy a močového měchýře nebo pacienti s rakovinou prsu s jakýmikoli známkami vzdálených metastáz.

9.4. Odběr krve: 6 ml periferní krve se odebere do vakuových nádob s polymerním gelem s aktivátorem sraženiny (Greiner Bio-One GmbH, Austrálie), ponechá se 15 minut. při pokojové teplotě ke sražení, následuje 10 min. centrifugací při 10 000 g při 4 °C, získaná séra budou rozdělena do alikvotů do 5 čistých Eppendorfových zkumavek a skladována při -80 °C až do biochemického hodnocení na Biochemickém oddělení, Farmaceutická fakulta, Univerzita Ain-Shams.

9.4.1 Skladovaná séra budou použita pro měření hladin cílových proteinů technikou ELISA za použití komerčně dostupných souprav ELISA podle pokynů výrobce.

9.4.2. Genomická RNA bude extrahována; Extrakce ncRNA ze vzorků séra a vyhodnocení purifikace. Kvantifikace úrovně exprese ncRNA pomocí qRT-PCR krok jedna plus. Pokračujeme extrakcí celkové RNA ze vzorku séra pomocí miRNeasy Mini Kit. Syntéza c-DNA bude následně provedena pomocí soupravy pro syntézu c-DNA VERSO (Thermo Scientific, USA).

Dále provedeme kvantitativní analýzy PCR v reálném čase (qRT-PCR) pomocí sybr green PCR master mix (Thermo Scientific, USA) a specifických primerů navržených pro cílové ncRNA a také pro housekeeping referenční gen.

10. STATISTICKÁ ANALÝZA 10.1. Data budou shromažďována, excelová tabulka, 10.2. SPSS IMB USA (SPSS, Chicago, IL) verze 20, bude použitý program nebo Stat4 nebo Graphpad Prism pro figurky, 10.3. Data budou testována na normalitu pomocí kalkulačky Shapiro-Wilk, 10.3.1. Normálně rozdělené proměnné se vyjadřují jako průměr + (SEM) a analyzují se pomocí dvou vzorků nezávislých Studentův t-test a ANOVA se použijí pro srovnání 2 nebo více skupin, pokud jsou normálně rozděleny.

10.3.2. Úprava a normalizace pro zkreslující faktory, jako je věk a BMI, .. mezi kontrolou a pacienty, stejně jako vícenásobná regresní analýza nebo ANCOVA k predikci zmatku, 10.3.3. Údaje, které mají být prezentovány jako medián (Rozsah), pokud nejsou normálně distribuovány, Mann-Whitney (U) nebo Kruskal-Wallis (H) budou provedeny pro srovnání mezi jakýmikoli dvěma nebo více nezávislými skupinami, v tomto pořadí, 10.4. P-hodnoty byly dvoustranné a považovaly se za významné, pokud P <0,05,11.